LC-MS样品中影响疏水性肽回收率的因素检测方案(液质联用仪)

WatersLC-MS样品处理过程中影响疏水性肽回收率的因素THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE，Moon Chul Jung、Kim Haynes、 Markus Wanninger， 沃特世公司，34 Maple Street Milford， MA 017572019年活特世公司 要使用LC-MS成功定量蛋白质和肽，必须持续关注工作流程中各个步骤的细节，包括样品前处理到色谱分离，再到质谱检测。分析人员常常忽视的一个细节是样品可能会在LC-MS进样之前损失，尤其是在使用收集板或样品瓶等容器储存样品的过程中。溶液中的某些蛋白质和肽很容易定量结果的准确性，进而限制LC-MS分析能力。使用阻断试剂是缓解非特异性吸附(简称NSB： Non-Specific Binding)问题最常用的解决方法，但这些试剂不一定能完全兼容下游LC-MS条件。本研究探讨了影响肽回收率的多种因素，并提出了一种不使用阻断试剂即可防止样品损失的系统方案 LC-MS设置 LC：配备固定定量环进样器的ACQUITY UPLCI-Class MS：配备通用离子源的Xevo TQ-S 色谱柱： CORTECS C+色谱柱，90 A， 1.6 pm， 2 进样体积：10pL，满环进样 流动相A：0.1%甲酸水溶液 流动相B：0.1%甲酸的乙腈溶液 流速：0.5 mL/min 梯度：流动相B在1.2 min内由15%增加至45%，然后用95%流动相清洗0.5 min， 之后重新平衡0.6 min 总运行周期： 2.8min 肽样品前处理 所有肽回收率实验均制备两组肽样品。一组样品使用含酸性或碱性改性剂的纯水-乙腈溶液制备，另一组样品为参比样品，使用相同的水-乙腈溶液制备，但添加0.1%大鼠血浆作为载体蛋白。肽回收率通过比较不含大鼠血浆的样品的肽峰面积与参比样品的峰面积计算。通过改变其它条件(例如样品储 存温度和储存时间、肽溶液的组 成、肽浓度等)研究这些因素如0 何影响肽回收率。 MW 去氨加压素特拉帕肽胰高血糖素 1069 4118 3482 胰岛素 5734 蜂毒肽 2846 如需下载此海报副本，请访问WWW.WATERS.COM/POSTERS 不同容器防止样品 损失所需的%ACN 聚丙烯样品板 市售低吸附样品板 厂，不应使用这类容器盛装样品。 减少非特异性吸附损失对于成功定量棘手肽类样品而言至关重要。如果不设法避免样品损失，可能会影响分析灵敏度和重现性，导致结果不准确。下面的例子显示了非特异性吸附损失如何导导校准曲线变形，进而影响肽定量分析的准确性生。 上图为示例校准曲线(50 pg/mL~100ng/mL)，由图可见，当分析物损失时，样品浓度与峰面积之间呈非线性关系(红色和蓝色曲线)。与此相比，在样品溶液中加入0.1%大鼠血浆(作为阻断试剂或载体蛋白)得到的校准曲线(紫色， r=0.998)，以及不添加载体蛋白，但使用QuanRe-covery板制备样品以避免样品损失得到的校准曲线(绿色， r=0.997)为线性生准曲线。所有样品均使用80：20水/乙腈+0.2%TFA制得，进样分析前在4℃下储存24h。 。在等待LC-MS进样时，蛋白质和肽可能会被样品容器吸附，并且可能无法回收。 ·此类样品损失不利于分析，会对回收率、灵敏度和重现性产生不利影响。 ·按照以下步骤优化样品储存条件，防止在容器中储存时发生样品损失。 1.选择合适的容器。 2.选择兼容下游分析的样品溶剂。 3.选择最佳的样品储存条件。 参考文献 1.MGJung Achieving Mavimum Protein andeptide Recovery.Sens any and. Reprodoit using quanRecovery沃特世白皮书：720006543EN(2019) ices， Adv Colloid 简介要使用LC-MS成功定量蛋白质和肽，必须持续关注工作流程中各个步骤的细节，包括样品前处理到色谱分离，再到质谱检测。分析人员常常忽视的一个细节是样品可能会在LC-MS进样之前损失，尤其是在使用收集板或样品瓶等容器储存样品的过程中。溶液中的某些蛋白质和肽很容易被容器表面吸附，导致样品永久损失。这种非特异性吸附(NSB)可能影响定量结果的准确性，进而限制LC-MS分析能力。使用阻断试剂是缓解非特异性吸附(简称NSB：Non-Specific Binding)问题最常用的解决方法，但这些试剂不一定能完全兼容下游LC-MS条件。本研究探讨了影响肽回收率的多种因素，并提出了一种不使用阻断试剂即可防止样品损失的系统方案。