食品中真菌毒素检测方案(液相色谱仪)

色谱质谱图 使用LC和LC/MS 测定食品中的真菌毒素 简介 真菌毒素是某些霉菌产生的次级代谢产物。这些分子对所有动物有机体都具有高毒性，即使在非常低的剂量下也会产生有害作用(神经毒性、肾毒性、肝毒性、肠毒性、免疫抑制和致畸作用)。真菌毒素污染的食品(尤其是蔬菜)会导致其代谢物在饲料或食品中积累，危及使用安全和健康。 污染可能发生在现场，也可能发生在运输、储存和/或加工的后续阶段，当自然存在于环境中真菌的孢子在合适温度和湿度条件下能够生长时，最终会产生真菌毒素。 霉菌生长环境曲霉属真菌收集后现场青霉菌属收集后现场禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、现场侧孢样镰刀菌轮枝镰孢菌、层出镰孢菌现场 表1 由于这些物质不仅存在于食品中，而且也存在于动物饲料中，因此人类暴露于污染中可能源于直接食用受污染的食品，也可能由于食用了源于有真菌毒素存在的动物饲料所污染的动物源性食品，如牛奶。 真菌毒素霉菌属于青霉属、曲霉属和镰刀菌属，生成的毒素类型因真菌属和种类的不同而各不相同。 真菌毒素具有高毒性，即使在非常低的浓度下 (ppb级)，也必须在最有可能产生毒素霉菌(谷物、坚果、牛奶和咖啡)的食品中采取控制措施。食品中常见的真菌毒素类别包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、单端孢霉烯族毒素类和玉米烯酮。 Funghi produttori e substrati potenzialmente contaminati dalle principali micotossine Micotossina Funghi produttori Prodotto contaminato Aflatossine B1. B2. G. G2 Aspergillus flavus， A.parasiticus Mais. frutta secca Aflatossina M Latte Aspergillus ochraceus， Cereali， caffe. uva，frutta Ocratossina A Penicillium verrucosum secca Patulina Penicillium spp.， Aspergillus Succhi di mela spp- Tricoteceni Fusarium graminearum，F.culmorum， F.sporotrichioides Cereali Zearalenone husanum gramneanm.F.culmorum， F.sporotrichioides Cereali Fumonisine F.verticilioides， F.proliferatum Mais 表2 食品中的真菌毒素依据 Reg.(EC) No.1881/2006(修订版)，根据食品中存在的污染物进行管控。 法规规定了最大污染物限值(以ug/kg表示)，限值取决于毒素和食品的性质。 下表列出了法规 (Reg.EC 1881/2006)允许的不同食品基质中真菌毒素最低限值，婴幼儿食品除外。 分析方法 配备常规检测器的 HPLC 一些真菌毒素具有自然荧光(B2、G2、M1......)，或者很容易通过化学衍生化得到(伏马菌素)或紫外线照射。对于这些分子，通常使用荧光检测器检测。在其他情况下，可使用常见的紫外- 毒素 最低浓度 液相色谱检测器 黄曲霉毒素 B1 B1 为 2ppb FL+衍生化 (曲霉属真 B2 (B1+B2+G1+G2) FL 菌) 为 4ppb G1 FL+衍生化 G2 FL M1 0.05ppb FL 曲霉属真 赭曲霉素A 2ppb FL 菌和青霉 棒曲霉素 10 ppb UWIS 菌属 镰刀菌素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 200 ppb UWIS 玉米烯酮 75ppb FL/UWIS B1+B2伏马菌素 800 ppb FL+衍生化 T2+HT2毒素 FL+衍生化 表3(*)本表不含 T2 和 HT2毒素的限值，因为法规尚未引入此类限值 可见检测器检测真菌毒素。荧光检测器具有高灵敏度等不容置疑的优点，但有时需要进行柱前或柱后衍生化。 典型的柱前衍生化可通过 TFA完成，而最广泛的柱后衍生化系统包括： Pickering、KobraCell 或紫外光衍生设备。 在某些情况下，可直接在流动相添加衍生化试剂，因此当需要在相同色谱运行状态下最终确定更多毒素时，梯度 HPLC 系统的使用会变得困难。 因此，为了在表3中规定的检测限范围内定量分析真菌毒素，必须使用配备紫外-可见和荧光检测器的 HPLC 系统以及衍生化系统。 仪器配置： UHPLC Flexar FX-10Flexar 自动进样器FL Flexar检测器 Chromera CDS Flexar FX 10 Kobra CellTM： 100 uA分析柱： Brownlee Pinnacle DB C18 HPLC色谱柱， 1.9um， 50mm×2.1mm i.d. 流动相： 水/乙腈/甲醇75-10-15+119mg溴化钾+350ul硝酸4M 流速：0.7mL/min； 6000psi荧光检测器：激发波长362nm发射波长435nm发射带宽：宽进样体积：2pl总运行时间：3 min. HPLC 配备质谱检测器 为使用配备常规检测器的 HPLC系统完成表3列出的真菌毒素完整分析，需使用由多个检测器组成的仪器配置。同样，有时候也需要根据特定基质中的毒素以不同的方法进行分析。 若使用诸如质谱检测器等通用检测器，可使用单一的分析方法，且无需借助任何衍生化系统。质谱检测器在电离过程识别出利用其产生离子的分子。 结果通常是测定其分子离子峰或加合峰，这与其化学性质和流动相组成相关。 最合适分析每种毒素的电离方法： ESI+或ESI- 样品制备 对于食品中真菌毒素的分析，取样起着至关重要的作用，并且是一项特殊法规 (Reg EC 401/2006) 的主题。在取样过程中，由于样品的非均质性，需要特别关注。 样品采集后，样品分析过程应符合 Reg.(EC) 401/2006 设定的要求， Reg.(EC) 882/2004附录三列举了评估所用方法的标准。在正确的采样后，下一步是样品制备。对于真菌毒素，通常可采用两种方式： 使用免疫亲和柱(IAC) 使用 SPE 柱 免疫亲和柱： IACs 基于适当固定在固定相上的单克隆或多克隆抗体。由于其选择性极佳，可从复杂的食品基质中快速提取真菌毒素。通常，样品在上样至免疫亲和柱之前需均质化，提取(例如使用甲醇/水)然后稀释。在使用合适的溶剂(甲醇)洗脱分析物之前，需使用合适的缓冲液淋洗色谱柱。通常可进一步浓缩甲醇相以提高检测限。 IAC 色谱柱仅可使用一次。 SPE (固相萃取)： SPE 柱是免疫亲和法的替代选择。该方法通常更节省成本，但同时具有更低的特异性和选择性。在上样之前，使用甲醇进行活化。随后淋洗并洗脱吸附的毒素。 分析方法 仪器： UHPLC Flexar FX-15 PerkinElmer Flexar 自动进样器 脱气系统 Flexar Peltier 柱温箱 SQ 300 MS 和 ESI Flexar FX 15 Chromera CDS 色谱和质谱方法 色谱法是一种独特的分析方法，能够分离和确定表3所示的所有真菌毒素-同时有正离子和负离子(棒曲霉素除外，因为其离子化效率差，使用此方法无法在法规要求的限值范围内对其进行定量，需要专门的样品制备)。 UHPLC 质谱检测器 分析柱： HRes DB AQ C18 (1.9um， 100mm， 透镜电压：-4000V 2.1mm 内径-部件号 N9303919) 流动相 端板电压： -5000V A. 用于 LCMS的超纯水+0.1%v/v HCOOH 毛细管入口：-6000V B.乙腈+0.1% v/v HCOOH 端板温度：高 线性梯度 干燥气温度：350℃ 步骤0：平衡时间4' 90%A-10%B 干燥气温度：12L/min 步骤1：运行时间12 -38%A-62%B 雾化气体压力：80psi 步骤2：运行时间4' -38%A-62%B 流速：0.65mL/min 进样体积： 5uL 表4 毒素 电离模式 毛细管 离子 驻留时间 Tr (min) 出口(V) B1 ESI+ 120 313.0 (M+H)+ 100 6.43 B2 ESI+ 120 315.0 (M+H)+ 100 6.05 G1 ESI+ 120 329.1 (M+H)+ 100 5.62 G2 ESI+ 120 331.0 (M+H)+ 100 5.28 M1 ESI+ 120 329.1 (M+H)+ 100 4.92 赭曲霉素A ESI- -90 402.2 (M-H)- 100 11.91 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 ESI- -60 341.0 (M+HCOO)- 100 1.51 玉米烯酮 ESI- -90 317.2 (M-H)- 100 11.74 FB1+FB2 ESI+ 120 FB1=722.4 (M+H)+ 200 11.22 FB2=706.3 (M+H)+ 200 14.73 T2+HT2毒素 ESI+ 120 T2=447.0 (M+Na)+ 100 8.25 HT2=489.0 (M+Na)+ 100 6.80 表5 针对分析的每种化学物优化了“毛细管出口”的V值，以便使用“RAMP”功能进行更好的定性/定量分析。当信号强度随施加电位的变化而变化时，可发现“毛细管出口”的最佳值。 标准溶液 从水/乙腈(1：1) +0.1%甲酸混合溶液中认证的标准品(Biopure TM) 开始，制备从1到1000ppb (1、10、100和1000ppb) 的标准混合物。 8PER(10.2：12.7)PSIM(722.4)，0.0，120，200000：FB1 60000000-40000000-Quc20000000- 0 2000 4000 6000 Component Name： FB1 Calibration Type： Linear Origin Treatment： None Equation：y=1.07123E+04x+3.60363E+05 Curve Statistics： Intercept： 3.60363E+05 Slope： 1.07123E+04 r2：0.999647887329309 毒素 标准 标准 标准 标准 限值 (ppb) 样品1 样品2 样品3 样品4 (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) B1 // 0.5 5.0 50.0 2 B2 0.05 0.5 5.0 50.0 4(适用于B1+B2+G1+G2) G1 0.05 0.5 5.0 50.0 G2 0.05 0.5 5.0 50.0 M1 // 0.5 5.0 50.0 0.05 赭曲 1.0 10.0 100.0 1000.0 2 霉素A 脱氧雪腐镰 刀菌烯醇 1.0 10.0 100.0 1000.0 200 玉米 1.0 10.0 100.0 1000.0 75 烯酮 FB1和 5.0 50.0 500.0 5000 800 FB2 T2+HT2 5.0 50.0 500.0 5000 毒素 6 PER(6.7：7.7)PSIM(447.0)，0.0，120，200000：HT22000000- 1500000- 0 1000000- co a500000- 0 Component Name： HT2 Calibration Type： Linear Origin Treatment： None Equation：y=3.50535E+02x-1.17735E+04Curve Statistics： Intercept： -1.17735E+04 Slope： 3.50535E+02 r2： 0.999735950097087 7 PER(0.0：6.7)PSIM(315.0)，0.0，120，100000： B22500000- 2000000 1500000- c o1000000-a 50000 0- .204060 Component Name： B2 Calibration Type： Linear Origin Treatment：None Equation：y=3.76867E+04x+1.33141E+04 Curve Statistics： Intercept： 1.33141E+04 Slope：3.76867E+04 r：0.999820158678736 表6 考虑到样品制备，根据表3评估校准曲线的范围。 在样品制备期间，未进行任何预浓缩即获得了校准曲线和结果。因此，与使用样品预浓缩并增大进样量的方法比，灵敏度降低约十倍。 校准曲线 以下是一些校准曲线的实例： 6 PER(0.0：16.0)NSIM(341.0)，0.0，-60，100000： 1000012000 该色谱图显示了所分析真菌毒素的色谱峰。由于化学性质不同，响应也不同；对黄曲霉毒素(底部的色谱图)而言，比例已经扩大，以便更好地突出色谱信号。 样品分析 认证样品分析如下： -花生中的黄曲霉毒素 -玉米淀粉中的 DON (Biopure TM) 使用两种不同的制备方法分析花生样品：特异性免疫亲和柱(Romer Labs Diagnostic GmbH) 和 SPE 柱 (Supra-CleanC18-500mg/3mL 货号 N9306438)。玉米淀粉和牛奶的分析使用IACs。 IACs采用其制造商定制的程序，而 SPE 柱按照下述方案进行提取和纯化： -将5g样品置于 100mL烧杯中，并加入100mL 含有水/甲醇 (3：2比例)以及2g氯化钠的溶液。 -搅拌45min， 使样品沉淀。离心15min。 -取 10mL上清液上样到预先活化好的 SPE柱，使用甲醇(2×3mL)和蒸馏水(2×3mL)在抽真空的装置下活化 ·在真空下静置干燥几分钟 -用3mL水/甲醇 (9：1比例)混合物淋洗。 -在真空下静置干燥几分钟。 -用3mL纯纯醇洗脱 SPE 柱。 -对收集的溶液氮吹干燥； -用1：1的0.5mL水/乙腈溶液进行再溶。样品现在可进行分析。 花生： 发现样品仅含有B1黄曲霉毒素。 对于花生样品，利用所示的两种提取技术进行分析，结果没有显着差异。 在具体情况中，结果还表明，改变淋洗溶液类型，检测值没有显着变化。 特别指出的是，通过测定获得以下结果： B1黄曲霉 毒素 IAC 按照程序 SPE， 仅使用水 进行 SPE 无淋洗 进行 SPE 淋洗 淋洗 14.2 13.8 ppb 14.45 12.1 ppb 色谱图 1 2 3 4 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 有关我公司完整的全球办事处设立情况，请访问 www.perkinelmer.com/ContactUs 使用 SPE 柱净化分析玉米淀粉样品。 得到如下色谱图。 DON 的样品回收率大致在80-85%之间。 结论 本方法说明了单四极杆确证为可替代复杂硬件配置的方案。此外，其灵敏度可达到现行法规(表3)要求的最低浓度。 该实验结果是在在标准样品制备后未进行任何样品浓缩而得到的。在某些情况下，采用样品浓缩能帮助获得更好的 LOD和LOQ。 真菌毒素是某些霉菌产生的次级代谢产物。这些分子对所有动物有机体都具有高毒性，即使在非常低的剂量下也会产生有害作用（神经毒性、肾毒性、肝毒性、肠毒性、免疫抑制和致畸作用）。真菌毒素污染的食品（尤其是蔬菜）会导致其代谢物在饲料或食品中积累，危及使用安全和健康。本文介绍一种使用LC 和LC/MS 测定食品中的真菌毒素的方法。