谷物中霉菌毒素检测方案(液质联用仪)

使用在线固相萃取法(SPE)-液相色谱--串联质谱法((LC-MS/MS)测定谷物中的霉菌毒素 霉菌毒素是由真菌产生的有毒次生代谢产物，能够引起人和动物患病和死亡。因此，许多国家和地区都制定了针对霉菌毒素检测和鉴定的法规和适用的容许限值(表1)。 样品前处理是成功分析食品基质中霉菌毒素的关键步骤。“直接稀释和进样”方法是将样品导入液相色谱/串联质谱分析的一种快速而简便的方法。然而，由于食物基质的复杂性，这种方法通常会由于基质效应导致重现性差。其他样品制备技术，如离线固相萃取(SPE) 和QUECHERS 法，采要采取多个耗时的步骤，并且易于引入认为误差。 为了克服这些问题并提高灵敏度，本文采用了与液相色谱/串联质谱系统联用的在线固相萃取(SPE) 进行样品富集。使用该方法，能够获得显着且有效的分析物浓度，从而避免了复杂而耗时的样品制备程序。 霉菌毒素 欧盟 美国 中国 新加坡 巴西 黄曲霉毒素 B1、B2、G1和G2总和 4 20 N/A 5 5 仅限黄曲霉毒素 B1 2 N/A 5*/20** 5 N/A T-2和HT-2毒素总和 75*** N/A N/A N/A N/A 伏马菌素B1和B2总和 800 N/A N/A N/A 400 赭曲霉素A 3 N/A 5* 3 10 麦角克碱 N/A N/A N/A N/A N/A 玉米烯酮 75 N/A N/A N/A N/A 玉米/花生制品 指示性水平(监管水平正在讨论中) 对于在线分析物预富集/富集和色谱分离，使用与 QSight@210 串联质谱联用的 PerkinElmer QSight@SP50 在线固相萃取系统。所有仪器控制、分析和数据处理均使用 Simplicity 3QTM软件平台进行。 在线固相萃取通过自动进样器中的两个附加六通阀和一个高压分液器(HPD)完成。如图1所示，阀门A专用于固相萃取，而阀门B 图1.QSight SP50 在线固相萃取 (SPE)系统示意图。 允许从直接进样到在线固相萃取模式的灵活切换。系统配置有一个 10 uL 不锈针针、一个1mL定量环、一个1mL注射器和一个2mL缓冲管。活化和平衡溶剂通过 HPD输送，两种溶剂在通过固相萃取柱时被引导至废液。然后，使用自动进样器注射器将样品吸入定量环中，随后通过萃取的溶剂从定量环转移至固相萃取柱。然后进行淋洗，以便将基质组分从固相萃取柱上洗脱。应该注意的是，初始测试表明，无论是否进行淋洗，分析物回收率都没有明显的差异；但是，为了减少样品中的的基质含量，将此步骤包含在内。然后，使用液相色谱梯度将分析物从固相萃取柱上洗脱至分析柱上。不需要采取单独的固相萃取洗脱步骤，因为集中在固相萃取柱上的分析物作为色谱分离操作的一部分将被直接洗脱至分析柱上。 就该方法而言，样品富集是通过将总计1mL 的样品加载到固相萃取柱上来完成的。该方法的固相萃取参数如表2所示。 使用能够容纳10mL 样品瓶的24位进样器(零件编号 N9300922；带有集成隔离套件的100个小瓶/瓶盖). 方法参数 固相萃取、液相色谱和串联质谱方法参数如表2-5所示。 表2.固相萃取法参数。 步骤 步骤类型 溶剂1 溶剂2 溶剂3 样品 (mL) (mL) (mL) (mL) 1 淋洗/活化 2.0 -- 2 平衡 - 2.0 - - 3 进样至1-mL环内 - - - 1.5* 4 进样至固相萃取柱上 - 1.5 - 5 淋洗 - - 1.0 5.5 min. 洗脱时间： 4.0 min. 表3.液相色谱法参数。 液相色谱柱 PerkinElmer Brownlee Analytical DB C18， 100 mm ×4.6mm ×3 um (零件编号 N9303863) 固相萃取溶剂 溶剂A：水加0.1%甲酸和5mM甲酸铵 溶剂B： 90：10水/甲醇加 0.1%甲酸和5mM甲酸铵 步骤 时间 (分钟) 流速 (毫升/分钟) %A %B 1 0.0 1.00 45 55 2 3.5 1.00 45 55 3 3.75 1.00 10 90 4 7.0 1.00 10 90 5 7.1 1.00 45 55 6 11.0 1.00 45 55 柱温箱温度 35°C 表4.串联质谱法参数。 化合物 ESI 模式 保留时间(分钟) 时间受控MRMTM组 母离子 碎片离子1(定量离子) EV1 CCL2 CE1 碎片离子2(定性离子) EV1 CCL2 CE1 黄曲霉毒素 G2 2.0 1.6-2.4 min 331.2 245.1 25 -125 -40 285.3 25 -120 -35 黄曲霉毒素 G1 + 2.3 1.9-2.7 min 329.3 243.2 25 -110 -35 283.2 25 -75 -35 黄曲霉毒素B2 2.7 2.3 -3.1 min 315.3 259.0 25 -95 -40 287.1 25 -90 -35 黄曲霉毒素B1 + 3.2 2.8-3.6 min 313.1 285.1 25 -100 -30 241.1 25 -125 -50 伏马菌素B1 5.0 4.6-5.4 min 722.4 352.3 25 -150 -45 334.5 25 -150 -50 HT-2毒素 + 5.0 4.6 -5.4 min 447.1 345.1 25 -75 -25 285.1 25 -95 -25 麦角克碱 + 5.1 4.6-5.4 min 610.4 223.1 25 -120 -45 268.2 25 -120 -35 T-2毒素 5.2 4.8 -5.6 min 489.2 245.2 25 -95 -35 387.1 25 -105 -25 赭曲霉素A + 5.3 4.8-5.6 min 404.3 239.1 25 -90 -30 358.1 25 -75 -20 伏马菌素 B2 + 5.4 5.0 - 5.8 min 706.3 336.4 25 -150 -45 318.3 25 -150 -50 玉米烯酮 + 5.4 5.0 - 5.8 min 319.3 283.1 25 -55 -20 231.0 25 -60 -20 参数 值 电离模式 ESI； 正 干燥气体 120 HSID 温度(℃) 320 雾化气体 400 电喷雾电压 (V) 4500 离子源温度 400 检测模式 时间受控 MRMTM 溶剂、标样和样品 所有溶剂均为液相色谱—一质谱级。黄曲霉毒素混合物(B1、B2、G1、G2)、HT-2毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素A和玉米烯希标样购自 Sigma-Aldrich@ (荷兰 Zwijndrecht)。麦角克碱、伏马菌素B1和伏马菌素B2(粉末形式)购自Fermentek Ltd (以色列耶路撒冷)。使用液相色谱-——质谱级乙腈制备伏马菌素B1和B2的储备溶液，并在液相色谱-质谱级甲醇中制备麦角克碱储备液。 然后，使用 80：20乙腈/水作稀稀释剂，用标准储备液制备标准溶液。所有校准液均使用相同的稀释剂通过连续稀释标准溶液制备。通过向5g均质玉米片或杂粮谷物样品中加入20mL80：20乙腈/水稀释剂制备提取物。然后，将悬浮液摇动30分钟，在3500 rpm 下离心10分钟并转移。然后，将澄清的淡黄色上清液加入相应的校准溶液。将1mL校准溶液加入到9mL 提取物中，使提取物中的校准溶液稀释10倍。在进样之前，将1mL加标提取物用9mL水进一步稀释，使之再稀释10倍。进样中的霉菌毒素的最终浓度比玉米片/杂粮谷物中的相应浓度低40倍(表6)。 结果和讨论 图2显示了十一种霉菌毒素分析物的标准混合物的色谱分离。使用极性和物理化学性质不同的分析物会增加分离的难度。这从色谱图中存在两组分析物(极性更强的早洗脱黄曲霉毒素和极性较弱的霉菌毒素)中可以看出。 表6.进样中的霉菌毒素分析物浓度和玉米片/杂粮谷物中的相应浓度范围。用 20 mL 萃取剂萃取 5g 样品。由于在进样前用水稀释加标提取物(10次)，因此进样中的最终浓度比玉米片/杂粮谷物中的最终浓度低40 倍。 分析物 1级 2级 3级 4级 5级 6级 7级 8级 9级 10级 样品范围 黄曲霉毒素B1 0.0005 0.001 0.002 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.02-20 黄曲霉毒素 B2 0.0005 0.001 0.002 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.02-20 黄曲霉毒素 G1 0.0005 0.001 0.002 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.02-20 黄曲霉毒素 G2 0.0005 0.001 0.002 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.02-20 麦角克碱 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 1 2 5 0.2-200 伏马菌素B1 0.2 0.4 0.8 2 4 8 20 40 80 200 8-8000 伏马菌素B2 0.2 0.4 0.8 2 4 8 20 40 80 200 8-8000 HT-2毒素 0.002 0.004 0.008 0.02 0.04 0.08 0.2 0.4 0.8 2 0.08-80 赭曲霉素A 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 1 2 5 0.2-200 T-2毒素 0.002 0.004 0.008 0.02 0.04 0.08 0.2 0.4 0.8 2 0.08-80 玉米烯酮 0.02 0.04 0.08 0.2 0.4 0.8 2 4 8 20 0.8-800 1级-10级：进样中的浓度。所有浓度单位均为 ppb 或 ng/mL。 因为麦角克碱有两个差向异构体的混合物存在于溶液中，所以在麦角克碱色谱图中可以观察到两个峰((两种异构体仅在一个立体源中心的构型上所有不同)。虽然这些异构体在色谱图上分离成两个峰，但在分析中作为一种化合物考虑。由于两个差向异构体之间的比例可以变化，因此将两个峰一致整合，以便进行定量。根据图3，发现色谱重复性表现出色(通过10次重复霉菌毒素混合物进样的色谱重叠显示)。 图3.掺入萃取剂(乙腈/水，80/20)的11种霉菌毒素的10次重复进样的叠加。 提取物中四种选定霉菌毒素的线性图如图4所示，R2值均高于0.995。即使在校准范围的低浓度端，待测物也显示出非常好的线性(见局部放大图)。这表明校准曲线的线性范围跨越从显着低于监管限(表1和表6)到高于监管限的若干个数量级。 图4.四种选定霉菌毒素的线性图。局部放大图显示浓度范围下限的线性图。 如表7中所列，基于各种霉菌毒素的平均1级校准标准响应，确定了各种霉菌毒素的定量限(LOQ)。定量限远低于最低监管限。1级校准标样的代表性 MRM 色谱图如图5所示。 表7.十一种分析物的 LOQ 计算值。 分析物 LOQ计算值((ppb) 分析物 LOQ计算值(ppb) 黄曲霉毒素 B1 0.010 伏马菌素B2 9.863 黄曲霉毒素 B2 0.013 HT-2毒素 3.198 黄曲霉毒素G1 0.011 赭曲霉素 A 0.157 黄曲霉毒素 G2 0.034 T-2毒素 0.146 麦角克碱 0.014 玉米烯酮 0.890 伏马菌素B1 2.547 图5.选定霉菌毒素1级级准标样的 MRM 色谱图 图6显示了选定分析物1级校准标样的50-uL直接进样(上图)与1000-uL固相萃取进样(下图)的比较结果。使用50-uL直接进样，在加标谷物提取物中只能可靠地检测到麦角克碱。相比之下，1000-uL 固相萃取进样允许在谷物提取物的1乡校准标样中检测和定量4种选定霉菌毒素，且麦角克碱的峰面积增加10倍。 图6.选定的霉菌毒素1级校准标样50-uL直接进样(上图)和1000uL 固相萃取进样(下图)(均在玉米片提取物中)比较结果。 以黄曲霉毒素B1为例，表7中按照每个样品的准确度%(面积)、CV%(面积)和离子比率，显示了所有校准液水平的进样重复性、回收率和标样验证结果。如绿色突出显示，所有值均在可接受的容差范围内。虽然没有显示，其他霉菌毒素的结果同样令人满意。如表中顶部所示，结果还证实在分析的玉米片样品中不存在任何可检测的黄曲霉毒素 B1。如图8所示，六种不同分析样品中的所有霉菌毒素的情况则并非如此。表8列出了所有检测到的霉菌毒素。然而，所有检测到的霉菌毒素都明显低于欧盟法规(最严苛的法规)规定的水平。 表7.黄曲霉毒素B1的样品分析结果和标样验证结果。 表8.在分析的样品中检测到霉菌毒素，以及与欧盟规定的水平的比较结果。 分析物 提取物1 提取物2 提取物3 提取物4 提取物5 提取物6 欧盟条例 个体 合计 2 N/A 4 N/A N/A N/A N/A 800 N/A 3 N/A 75 N/A 75 黄曲霉毒素 B1 黄曲霉毒素B2 黄曲霉毒素 G1 黄曲霉毒素 G2 麦角克碱 0.01 0.01 0.04 0.07 伏马菌素 B1 伏马菌素B2 赭曲霉素A 0.03 HT-2毒素 1.43 1.8 1.64 T-2毒素 1.58 1.41 玉米烯酮 0.97 3.03 0.07 所有浓度以 ppb (ng/mL) 为单位。N/A=未检出。 为了评估来自玉米片和杂粮谷物的基质效应，将掺有相应浓度的霉菌毒素的提取物的校准曲线与在溶剂中纯化制备的校准曲线进行比较。尽管某些分析物的基质效应显着(表9)，但来自不同玉米片和杂粮谷物的六种不同提取物的比较结果显示样品与样品之间的基质效应差异很小。通过比较掺入提取物中的分析物和加入溶剂中的分析物的斜率系数来计算基 质效应(图7)。即便基质效应在不同的样品提取物之间和不同浓度的分析物之间没有显着差异(表9)，并且在几个数量级上实现了良好的线性，仍建议使用基质匹配的校准曲线作为在玉米片和杂粮谷物中霉菌毒素分析中补偿基质效应的可行且稳健的方法。 表9.校准曲线的R²值和加标到六种不同的玉米片和杂粮谷物提取物中的霉菌毒素的基质效应。基质效应显示为六种提取物的平均值，其中单独的柱状图显示标准偏差。基质效应表示为提取物中的信号除以纯溶剂中的信号。基质效应低于 100%表示离子抑制，而基质效应高于100%表明离子增强。 分析物 提取物1 提取物2 提取物3 提取物4 提取物5 提取物6 基质效应( (%) STDEV(%) 黄曲霉毒素B1 1.000 0.999 1.000 0.999 0.999 1.000 60 5 黄曲霉毒素 B2 1.000 0.999 0.998 0.999 0.999 1.000 57 5 黄曲霉毒素 G1 1.000 0.999 0.999 1.000 1.000 1.000 48 8 黄曲霉毒素 G2 1.000 0.999 1.000 1.000 0.998 1.000 43 6 麦角克碱 0.996 0.997 0.987 0.992 0.994 0.998 51 11 伏马菌素B1 0.999 0.999 0.998 0.999 0.998 0.998 135 6 伏马菌素B2 0.996 0.997 0.995 0.998 0.997 0.996 128 7 HT-2毒素 0.985 0.993 0.994 0.992 0.960 0.979 3 2 赭曲霉素A 0.999 0.999 0.998 0.999 1.000 1.000 87 5 T-2毒素 0.993 0.985 0.999 0.982 0.988 0.987 13 5 玉米烯酮 0.998 0.998 0.998 0.998 0.999 0.998 54 7 图7.黄曲霉毒素 B1 和赭曲霉毒素A的十点校准曲线。纯溶剂(80/20乙腈/水)中的校准曲线用红色显示。来自五种不同玉米片和一种杂粮谷物的提取物的校准曲线都显示出非常相似的结果。通过比较斜率系数，得到表9中所示的基质效应。 ( ● · 本研究使用与 QSight 210 串联质谱仪联用的 PerkinElmerQSight SP50 在线固相萃取系统有效且稳健地完成霉菌毒素在线固相萃取上样、色谱分离和定量。 ) ( ● · 由于独特的大容量固相萃取柱和高富集因子，本法不需要使用大量样品，从而节省时间、减少实验室浪费、提高效率，同时增加标准液相色谱一串联质谱系统的灵敏度。 ) ( · 由于 Simplicity 3Q 软件在在线固相萃取/色谱过程中自动为流动进样做好准备，因此样品制备和分析所需的总时间被 缩短至每个样品12.5分钟。 ) ( ● · 作为固相萃取前处理阶段的一部分，该程序能够减小溶剂消 耗量(每个样品≤10mL)。 ) ·该方法提供了出色的在线样羊前处理/预富集和色谱重复性，并且允许 LOQ显著低于监管水平。 ·获得用于同时分析11种霉菌毒素的基质匹配的十点校准曲线。浓度范围超过三个数量级的所有霉菌毒素均获得优异的线性。 。预计使用本文定义的方法/程序，以及完成监测饮用水中低浓度 PPCP 的基本任务。 ( 参 考 文 献 ) ( 1. W. M. R euter， A. Dalmia“ A nalysis of Mycotoxins in Multi-Grain and Corn Cereals without Derivatization by LC-MS/MSUsing Time-Managed MRMs" Application Note， P e rkinEl m er， Inc. Shelton ， CT(2017). ) ( 2. http：//www.mycotoxins.info/regulations. ) CHN_ PKI 样品前处理是成功分析食品基质中霉菌毒素的关键步骤。“直接稀释和进样”方法是将样品导入液相色谱/ 串联质谱分析的一种快速而简便的方法。然而，由于食物基质的复杂性，这种方法通常会由于基质效应导致重现性差。其他样品制备技术，如离线固相萃取（SPE）和QUECHERS 法，需要采取多个耗时的步骤，并且易于引入认为误差。为了克服这些问题并提高灵敏度，本文采用了与液相色谱/ 串联质谱系统联用的在线固相萃取（SPE）进行样品富集。使用该方法，能够获得显着且有效的分析物浓度，从而避免了复杂而耗时的样品制备程序。