菌渣中头孢菌素 C 残留检测方案(快速溶剂萃取)

DIONEXA partof：ThermoFisherS CIENTIFICRASE-SH-110830 ASE-HPLC分析检测菌渣中的头 孢菌素C残留 检测项目 头孢菌素C 仪器设备 ASE350 UltiMate3000 HPLC系统： DGP-3600 WPS-3000 TCC-3000 DAD-3000 参考应用文献 方法开发 车金水 最终审核 叶明立 1. 样品前处理方法： 准确称取1mL菌渣原液(烘干样品取0.5g)，与石英砂混合均匀后倒入事先垫好玻璃纤维素膜的萃取池(10mL， SST)中，进行 ASE 萃取。定容至25mL， 过 0.45um滤膜，待HPLC 分析。 2. ASE 萃取条件 a.萃取溶剂：水 b. 萃取温度：40℃ c. 预热时间：5 min d.静态萃取时间： 5min e.循环次数：2次 f.吹扫体积：60% g.吹扫时间： 90s h. 萃取池：10mL SST i.总萃取时间： 20min j. 总萃取体积：20mL 3.HPLC条件 a. 色谱柱： Acclaim C18， 120A， 4.6mm*250mm*5um b.流动相：A：乙腈； B： 0.1%磷酸溶液(pH=2.3) 表1HPLC溶剂梯度表 时间/min 流动相A 流动相B -5 5 95 0 5 95 20 40 60 25 40 60 25.1 5 95 C.流速：1mL/min d色谱柱温度：30℃ef.：进样量： 10pL 检测波长： UV@254nm 4.标准色谱图和样品色谱图 图1标准样品色谱图(头孢菌素C100ug/mL) 图2原样(湿样)色谱图 图3烘干样品色谱图 5条件选择5 溶剂选择 由于头孢菌素C 极易溶于水，本实验采用水作为头孢菌素C的萃取溶剂，取得了不错的实验结果。 5.2萃取温度选择 本实验分别研究了40℃、60℃、80℃和100℃作为萃取温度，探究对萃取头孢菌素C的萃取效果。实验结果表明：随着萃取温度的提高，头孢菌素C的萃取效率下降，可能为头孢菌素C发生了热降解。 5.3静态萃取时间及循环次数选择 本实验采用 5min 作为静态萃取时间，对同一样品进行了单次循环实验。实验结果表明，第一次萃取循环对头孢菌素C的萃取量占3次萃取量的83.0%；第二次萃取循环对头孢菌素C的萃取量占3次萃取量的14.0%；第三次萃取循环对头孢菌素C的萃取量仅占3次萃取总量的3.0%。所以本实验采用两次萃取循环作为萃取头孢菌素C的萃取循环次数。 6.实验结果 6.1 色谱数据 本方法分别以5.0、10.0、25.0、50.0和100.0ug/mL 为标准液溶度，做青霉素标准曲线，得出结果如下表2。 表2标准曲线数据表 No. Peak Name Cal.Type Points Rel.Std.Dev.Coeff.Det. Offset Slope 0.0692 图7标准曲线图 表3平行进样色谱峰数据(n=3) Sample No. Sample Name Ret.Timemin Area mAU*min HeightmAU Plates 1 烘干样品 8.657 7.4823 103.0007 92948 2 烘干样品 8.660 7.3094 100.1802 92558 3 烘干样品 8.657 7.1697 98.3715 92483 Average： 8.658 7.3205 100.5175 92663 Rel.Std.Dev： 0.023% 2.139% 2.321% 0.269% 图8同一样品平行性实验(n=3) 6.1加标回收实验数据 同时本实验分别对原样和烘干样品进行加标回收实验，实验结果见表5： 表2加标回收实验数据 样品 本底值 加标值 实测值 回收率 ug/mL /ug/mL /pg/mL /% 原液 42.26 50.00 93.12 101.7 烘干样品 40.63 50.00 91.88 102.5 图4原液样品及原液样品加标色谱图(1.样品；2.样品加标) 图5烘干样品及烘干样品加标色谱图(1.样品；2.样品加标) 6.2样品测试数据 本实验对原液样品，烘干样品分别萃取三次，实验结果如下表3. 表3样品实验结果 样品 萃取次数 萃取率 平均萃取率 RSD/% 1 原液样品 2 2346.8 2302.8 2298.1 2.2 3 2244.7 1 4129.0 4039.6 烘干样品 2 4033.6 2.2 3 3956.4 注：原液样品单位： ug/mL；烘干样品单位为： ug/g 7.总结 本方法采用 ASE 萃取菌渣原液及菌渣烘干样品中头孢菌素C， 结合HPLC 分析头孢菌素C的含量。实验结果表明， ASE 适合萃取菌渣中的头孢菌素C，加标回收率能够达到101.7%-102.5%对原液样品和烘干样品进行平行萃取，其平均萃取率分别为2298.1ug/g 和4039.6ug/g， 其 RSD 分别为 2.2%和2.2%，均满足分析要求。 本方法采用 ASE 萃取菌渣原液及菌渣烘干样品中头孢菌素 C，结合 HPLC 分析头孢菌素 C 的含量。实验结果表明，ASE 适合萃取菌渣中的头孢菌素 C，加标回收率能够达到101.7%-102.5%对原液样品和烘干样品进行平行萃取，其平均萃取率分别为 2298.1µg/g 和4039.6µg/g，其 RSD 分别为 2.2%和 2.2%，均满足分析要求。