乳与乳制品中三聚氰胺检测方案(二手分析仪器)

食品科学※分析检测2502010， Vol.31， No. 04 高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺及其不确定度分析 杨洋，徐春祥，车文军 (江苏省产品质量监督检验研究院，江苏南京 210029) 摘 要：建立高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺结果不确定度评定的数学模型，全面考虑测量过程中的不确定度来源，分别运用最小二乘法对标准曲线拟合的不确定度，以及极差法对测定次数较少时引起的不确定度进行评定。结果表明，取样量2.00mg时，测定奶粉中三聚氰胺含量为(2.00±0.088)mg/kg。本方法适用于高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺的不确定度评定。 关键词：不确定度；高效液相色谱；三聚氰胺；奶粉 Uncertainty Evaluation of HPLC Determination of Melamine in Milk Powderchromatography YANG Yang， XU Chun-xiang， CHE Wen-jun (Jiangsu Provincial Supervising and Testing Institute for Products Quality， Nanjing 210029，China) Abstract： The sources of uncertainty in high performance liquid chromatographic (HPLC) determination of melamine in milkpowder were fully analyzed according to the calculation formula of melamine. Each uncertainty component was modeled.Uncertainty evaluation was conducted for fitting of standard curve of melamine and less measurement times by least squaremethod and extreme deviation method， respectively. HPLC determination with uncertainty evaluation by the method gave the(2.00±0.088)mg/kg melamine content in a randomly inspected commercial milk powder (weighed 2.00 mg). This method provesto be applicable to the uncertainty evaluation of HPLC determination of melamine in milk powder. Key words： uncertainty； HPLC； melamine； milk powder 中图分类号：0657.72 文献标识码： A 文章编号：1002-6630(2010)04-0250-04 三聚氰胺(melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料，俗称蜜胺。因其含氮量大于66%，且我国通常采用“凯氏定氮法”估测食品和饲料中的蛋白含量，聚氰胺常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被称为“蛋白精”。但三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的。本研究针对高效液相色谱法(HPLC)测定乳制品中三聚氰胺(GB/T 22388一2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》)，进行不确定度的测量和评定，以期为评定测量结果质量提供科学依据。 材料与方法 1.1 材料与试剂 样品为市场随机抽查的奶粉。 三聚氰胺高纯试剂(纯度>99.5%) Dr.Ehrenstorfer 公司；庚烷磺酸钠、甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备 Waters2695 高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)：Avanti J-E离心机 Beckman Conlter公司； AB265-S分析天平(感量为0.00001g) Mettler Toledd公司；超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司； Agilent SCX 阳离子交换固相萃取柱(60mg/3mL) 测定的环境条件：温度(20±5)℃，相对湿度≤75%。 1.3 样品处理 参照 GB/T 22388—2008 的高效液相色谱法进行。 1.4 色谱条件 色谱谱： Cis柱(150mm ×4.6mm， 5pm)； 流动相：10mmol/L柠檬酸、10mmol/L庚烷磺酸钠缓冲溶液(NaOH ( 作 者简 介 ： 杨 洋 ( 1 979一)， 女 ，工 程 师 ，博 士 ， 研究方 向为食品、化 妆 品 检 测 。 E-m ai l ： yy2304@126.com ) 调节 pH3.0)：乙腈= 90：10(V/V)；检测波长：236nm；流速：0.8mL/min；柱温：30℃，进样量：20uL。 2 结果与分析 2.1 数学模型 式中：X为试样中三聚氰胺的含量/(mg/kg)； A为样液中三聚氰胺的峰面积；c为标准溶液中的三聚氰胺量/(ug/kg)； V为样液最终定容体积/mL； A、为标准溶液中三聚氰胺的峰面积； m 为试样的质量/g。 2.2 不确定度的来源分析12-4) 从测定过程和确定的数学模型分析，三聚氰胺含量测定的不确定度主要来源于：标准物质u(S)、标准工作曲线的拟合u(Std)、样品峰面积的测定u(As)、样品称量u(m)、定容体积u(V)、样品处理操作过程u(P)的差异等几个方面。 2.3 不确定度的评定 2.3.1 标准物质的不确定度 标准物质不确定度包含标准物质、标准储备液和标准工作液配制过程引入的不确定度。 2.3.1.1 标准物质引入的不确定度评定 根据标准物质证书提供的信息，三聚氰胺的不确定度为±0.5%，按正态分布考虑，包含因子k=3， 属B类评定，则有相对标准不确定度为： 2.3.1.2 标准储备液配制过程引入的不确定度评定 标准储备液的配制过程是精是称取0.10000g三聚氰胺，加入甲醇溶液(1：1，V/V)溶解并定容至100mL，质量浓度为 1.0000mg/mL。 根据称量使用的电子天平检定证书，其最大允许误差为±0.01mg，其置信水平99%，按正态分布考虑，包含因子k=3，则标准不确定度为 um =0.01mg/3=0.00333(mg)。称标样量为0.10000g，则其相对标准不确定度为： Urelm= 0.00333mg/0.10000g=3.33×10 该过程使用的玻璃量具，按照 JJG 196一2006《常用玻璃量器检定规程》51的要求，均有相应的最大容量允差，按矩形分布考虑， k=J3. 100mL容量瓶(A级)的标准不确定度来源为： ①按检定证书书定其最大允许误差为±0.10mL，按照矩形分布换算成标准偏差为： Urel(0)=0.0577mL/100mL=0.000577 ②充满液体至容量瓶刻度的变动性，通过重复测定进行统计，重复10次统计出标准偏差为0.12mL 从而引起的相对不确定度： urei(n)=0.12mL/100mL=0.0012。 ③实验室的温度波动范围一般为±5℃，20℃玻璃膨胀系数为2.5×10/℃，水体积膨胀系数为2.1×104/℃，甲醇体积膨胀系数为1.2×103/℃，实验过程中使用的甲醇溶液(1：1，V/V)的平均体积膨胀系数为7.0×10~4/℃。容量瓶校准温度与使用温度不同引起的体积不确定值： -2.5×10)×100×5=0.3375(mL) 按照矩形分布换算成标准偏差为： AV/k=0.3375//3=0.1948(mL) Urel(t)=0.1948mL/100mL=0.0019 以上3项合成得出 Urely=0.000577+0.00122+0.0019=0.0023 因此，标准储备液配制过程的相对不确定度： Urel 储备液=√(3.33×10°)+0.0023=0.0023 2.3.1.3 标准工作液配制过程产生的不确定度评定 标准工作液是由三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的质量浓度分别为0.8、2、20、40、100ug/mL。标准工作液制备过程使用了一系列玻璃量具，按照 JJG 196一2006I5l的要求，均有相应的最大允差，按照矩形分布考虑，k=/3，相对不确定度分量见表1. 表1 标准系列配制过程中量具校准引起的不确定度 Table 1 Uncertainty aroused from errors in calibration of volumetricflasks and pipettes used in preparation of standard series 玻璃量具 最大允差/mL标准不确定度相对标准不确定度 100mL单标线容量瓶A级 ±0.10 0.0577 u标=5.77×10 1mL分度吸量管A级 ±0.008 0.00462 u标2=4.62×10° 2mL分度吸量管A级 ±0.012 0.0069 u标3=3.45×10 10mL分度吸量管A级 ±0.05 0.0289 u标=2.89×10 由表1数据合成的相对标准不确定度： uy=Jupi+ukv2+u标v3+U标4=0.0065 表2 温度变化引起的标准系列配制过程中的不确定度 Table 2Uncertainty aroused from effect of temperature changeon volumetric glass wares in preparation of standard series 玻璃量具 AV/mL 标准不确定度相标准不确定度 100mL单标线容量瓶A级 1.8×10+×100×5 0.0520 u标=5.2×10 1mL分度吸量管A级 1.8×104×1×5 0.000520 u标n=5.2×10 2mL分度吸量管A级 1.8×10×2×5 0.00104 u标n=5.2×10 10mL分度吸量管A级 1.8×104×10×5 0.00520 us=5.2×10 标准工作液配制过程温度变化产生的不确定度评定见表2。标准工作液是用流动相稀释配制的，流动相是 10mmol/L 柠檬酸、10mmol/L 庚烷磺酸钠缓冲溶液-乙腈(90：10， V/V)，乙腈的含量较低，因此只考虑水的体积膨胀。实验室的温度波动范围一般为±5℃，20℃玻璃膨胀系数为2.5×105/℃，水体积膨胀系数为2.1×10/℃，假设温度变化是矩形分布。 由表2得到相对标准不确定度： ui=ju标n+U标r2+U标3+U标4=0.0021 因此，标准工作液配制产生的不确定度： Urel标出=/0.00652+0.0021=0.0068 由上述2.3.1.1、2.3.1.2、2.3.1.3节中不确定度分量，得到三聚氰胺标准物质的相对标准不确定度： 2.3.2 标准工作曲线拟合的不确定度分量 用最小二乘法拟合标准溶液质量浓度-峰面积曲线，分别测定5种质量浓度的三聚氰胺标准液0.8、2、20、40、100ug/mL，每种质量浓度分别测3次，得到相应的峰面积A，测定的结果见表3。 表3 最小二乘法拟合标准溶质量液质量浓度-峰面积结果 Table 3 Curve data of standard solution concentration versuspeak area fitted by least square method X质量浓度/(mg/L) 0.8 2.0 20 40 100 Y： 27254 69004 701019 1400993 3506243 Y峰面积/(Au·s)Y 27089 69035 701375 1402018 3506433 Y 27172 69020 701197 1401506 3506338 利用 Origin 软件拟合得到线性回归方程： Y=35072X一884.42，即拟合直线的斜率b和截距a分别为35072和884.42。 峰面积测量的标准偏差S为： 应用该曲线进行测量时，对被测样品处理溶液测量两次，即p=2，测得处理液中三聚氰胺的最佳估计值为2.00mg/kg。校准曲线拟合的标准不确定度u(Std)为： 标准工作曲线拟合的相对不确定度： 2.3.3 ：样品峰面积测量的不确定度评定 此项包含了重复进样峰面积测量产生的不确定度、仪器数据处理系统引入的不确定度和溶液进样量的不确定度。 2.3.3.1 峰面积重复测量产生的不确定度 表4 重复进样测量结果 Table 4 Results of replicate determination for peak area 进样次数 1 2 3 4 5 6 平均值 峰面积(A) 69004 69035 71020 70981 70889 70438 70228 属A类评定，由表4数据计算。由于测量次数较少，根据JJF 1059一1999《测量不确定度评定与表示》6中，采用极差法进行评定，其中n=6，C=2.53。 峰面积重复测量的相对标准不确定度： urel A=A=0.0113。 2.3.3.2 仪器数据处理系统引入的不确定度 根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%~1%，取1%，按均匀分布考虑，B类评定，峰面积的相对不确定度分量ui=1%/ 3=5.77×103 液相色谱仪测定用微量进样器进样(不确定度1%)，按均匀分布考虑，B类评定，则此项相对不确定度分量uz=1%//3=5.77×103 仪器数据处理系统引入的不确定度： u仪=(5.77×103)+(5.77×103)=0.0082 由此，得到样品峰面积测量的不确定度评定： Urei(As)=/0.01132+0.0082=0.0140 2.3.4 称样量的不确定度评定 根据称量使用的电子天平检定证书，其最大允许误差±0.01mg， 其置信水平99%，按正态分布考虑，包含因子k=3，则标准不确定度为u(m)=0.01mg/3=0.00333(mg). 样品称样量为2.00g，则其相对标准不确定度为： Urei(m)= 0.00333mg/2.00g=1.66×10° 2.3.5 样品处理液定容体积的不确定度评定 样品经提取、净化、洗脱等预处理后，洗脱液用氮气吹干，残留物用1mL流动相定容。 2.3.5.1 定容体积的相对标准不确定度 定容采用1mL单标线吸量管(A级)，按照检定规程 JJG 196一2006I5l要求，其容大容量允许误差为±0.007mL，即相对允许误差为±0.7%，按矩形分布考虑，B类评定，则定容体积的相对标准不确定度为 urei(Vo)=0.7%//3=0.00404。 2.3.5.2 1mL单标线吸量管校准温度与使用温度不同引起的体积不确定度： AV=V-V2=(0C玻璃)×V×△T=1.8×104×1×5=9.0×10(mL) 按照均匀分布换算成标准偏差为 AV/k=9.0×10413=5.2×104(mL) urei(V)=5.2×10*mL/1mL=0.00052 由以上两项合成得出urei(V)=/0.004042+0.00052=0.00407 2.3.6 试样处理操作过程产生的不确定度的评定 此项包含了方法重复性测量的不确定度和加标回收率的不确定度。 2.3.6.1 重复性测量的不确定度 该不确定度属A类评定，采用同一样品进行重复实验进行评估，步骤覆盖实验方法的全过程。实验依照GB/T 5009.1一2003《食品卫生检验方法：理化部分总则》71规定，根据批号随机取羊。测量数据见表5。 表5 奶粉中三聚氰胺的含量测量值水平 Table 5Results of replicate determination for melamine in arandomly inspected commercial milk powder 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X 2.11 1.98 2.02 2.09 1.97 1.89 1.95 1.99 2.05 1.91 X 2.00 测量重复性的标准不确定度为 最佳估计值为X=2.00mg/kg， 则测量重复性的相对不确定度为： 2.3.6.2 加标回收率的不确定度 因样品前处理不完全或处理过程中三聚氰胺的损失，通过添加三聚氰胺(质量浓度 5mg/L)计算加标回收率。实验结果得到，本法加标回收率为96.5%~101.1%.加标回收率的不确定度按 JJF 1059一199916中，得到：u²R=-(b-+b-)12一 加标回收率的标准不确定度为： 2.4 相对标准不确定度各分量汇总 表6 相对标准不确定度一览表 Table 6List of relative standard uncertainties over the wholedetermination procedure of melamine in milk powder 分量名称 不确定度来源 类型 相对标准不确定度 标准物质引入的不确定度 B u(S) 标准储备液配制引入的不确定度 B 0.0072 标准工作液配制过程引入的不确定度 B u(Std) 标准工作曲线的拟合 A 0.00635 重复进样峰面积测量产生的不确定度 A 0.0140 u(As) 仪器数据处理系统引入的不确定度 B u(m) 样品称量 B 1.66×106 u(V) 定容体积 B 0.00407 u(P) 样品处理操作过程 A 0.01328 2.5 合成标准不确定度评定 由表6中各相对不确定度合成： urel(X)=Ju'rel(S)+u’re(Std)+ure(As)+u're(m)+u’re(V)+u’rei(P)=0.022 2.6 扩展不确定度评定 扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信水平95%，则k=2。 试样中三聚氰胺含量测定的相对扩展不确定度 u=urei(X)×k=0.044。表5计算得试样中三聚氰胺含量的最佳估计值(X)=2.00mg/kg，故其扩展不确定度u=2.00mg/kg×0.044=0.088mg/kg. 3 结 论 高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺含量，当取样量为2.0g， k=2(95%置信度)，测量奶粉中三聚氰胺的含量结果为(2.00±0.088)mg/kg。 ( 参考文献： ) ( [1] 国 家质量监督检验检疫总局. G B/T 22388-200 8原料乳与乳 制 品 中 三 聚 氰胺检测方法[S] . 北京：中 国标准 出版社，20 08. ) ( [21 蔡 秋 ，朱明.高效液相色谱法测定茶饮料 中 苯甲酸结果 不确 定 度 评 定 [ J ] .食品科学，20 07，28(2)：2 7 7- 2 80 ) ( [3] 王 巍，葛延辉，刘 思 洁，等.高效液相色谱法测定饮 料 中柠檬黄含量 的不 确 定度分析[J]. 中国卫生工 程学， 2 008，7 (5) ： 298-300. ) ( [4] 刘燕，陈 利 国，彭新凯，等.气相色谱法测定果冻中环己基氨基磺酸钠(甜蜜 素 )结果 不 确定度评定[ J ] . 食 品与机械 ， 2 008 ， 24 (2) ： 110-113. ) ( [51 国 家质量监督检验检疫总局. JJ G 19 6一 20 06常用 玻 璃量器检定规程[ S] . 北 京：中国计量出版社，200 6：6-9. ) ( [61 国 家质量监督检验检疫总局. JJF 105 9 一19 99 测量 不确定度 评 定 与 表示[ S] . 北 京：中国计量 出 版社，19 99：1-31. ) ( [71 国 家质量监督检验检疫总局. GB/ T 5009.1一2003 食品卫生检验方法理化 部 分总则[S ]. 北京： 中 国标准 出 版社 ，2 00 6. ) 高效液相色谱法的优点在于分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广；与气相色谱法相比具有的优点：不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率；一般在啊室温下分析即可，不需高柱温。