合成多肽中杂质检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent生物 QC 检测 Trusted Answers 使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus色谱柱分析合成多肽杂质 Veronica Qin 安捷伦科技有限公司 通常，使用 UV 检测的多肽色谱分离是通过 C18柱以及三氟乙酸(TFA) 改性的流动相完成，这种方法可以改善分离度，但同时会抑制质谱(MS) 信号。甲酸(FA)是用于MS检测的首选流动相改性剂，但它可能会导致传统 C18 柱无法达到最佳分离效果。本应用简报介绍了通过单一液相色谱方法，采用 Agilent AdvanceBio PeptidePlus 色谱柱分离合成多肽杂质，并使用 UV 或 MS进行检测。本方法使用 FA 作为流动相改性剂，可以提供足够的分离度以鉴定并定量多肽杂质。 大多数多肽药物是通过固相多肽合成进行生产。合成多肽相关的杂质可能来自原料、生产过程，或者在生产或储存过程中因降解而产生。传统上，使用反相色谱柱实现多肽分离，并以 TFA 作为流动相改性剂， UV 作为检测器。然而，由于TFA 会抑制 MS信号，因此它并不是 MS的理想选择。在 LC/MS 方法中鉴定杂质峰时， FA 是首选的流动相改性剂，但它会导致传统 C18柱无法达到最佳分离效果。TFA (pKa=0.23) 可以降低 pH 值，使未烷基化的硅醇基位点质子化，不留下与带正电荷的多肽相互作用的负电荷。此外， TFA 阴离子能够与带正电荷的多肽相互作用，有利于形成良好的峰形。与此相反， FA (pKa=3.77) 的酸性比 TFA 弱，无法将 pH降低到使所有硅醇基位点质子化。 FA 与带正电荷的多肽之间的相互作用较弱，因此硅醇基与多肽之间的相互作用并不会完全被阻断。与使用TFA 作为流动相改性剂相比， FA 会导致峰展宽、拖尾、分离度以及峰容量降低。之前我们已经证明 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱具有混合带电表面固定相，与其他厂家色谱柱相比，使用 FA 作为改性剂时可提供更高的峰容量和更好的分离度。本应用简报介绍了可进行 UV 或 MS检测的单一液相色谱方法，并使用 FA 作为流动相改性剂分离合成多肽杂质。它适用于使用LC/MS 进行峰鉴定，通过 LC/UV 进行定量和质量控制，使 LC/UV 和 LC/MS 之间的方法转移更加容易。 材料 Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪包括如下配置： 合成多肽三氟醋酸比伐卢定水合物购自Selleckchem， 与0.1%甲酸水溶液复溶至1mg/mL。 Agilent 1290 Infinity 二元泵(G4220A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器(G4226A) Agilent 1290 Infinity 柱温箱(G1316C) Agilent 1260 Infinity ll二极管阵列检测器 (DAD) (G7115A) 液相色谱条件 参数 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱仪 色谱柱 Agilent AdvanceBio Peptide Plus， 2.1×150mm (部件号675950-902) 柱温 60°C 流动相 A) 0.1%甲酸水溶液B) 0.1%甲酸乙腈溶液 流速 0.4mL/min 梯度 时间(min) %B0 152 1522 3524 9526 9526.1 15 后运行时间 5分钟 进样量 5 pL (UV)； 1pL(MS) 质谱条件 参数 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 离子源 双安捷伦喷射流 气体温度 350°C 干燥气流速 10 L/min 雾化器气体 30 psi 鞘气温度 275°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 4000V 喷嘴电压 0V 碎裂电压 125V 锥孔电压 65V Oct 1 RF Vpp 750V 质量数范围 m/z100-1700(MS)； m/z 50-1700 (MS/MS) MS扫描速率(质谱图/秒) 8 MS/MS扫描速率(质谱图/秒) 3 采集模式 正，扩展动态范围(2GHz) 碰撞能量 3.6*(m/z)/100-4.8 质谱系统 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 数据处理 Agilent OpenLab 2.2 CDS 处理 LC/UV 数据。 LC/MS 数据由 Agilent MassHunterBioConfirm B.07.00 和B.09.00软件进行处理，该软件具有预测插入、缺失以及各种修饰的能力，包括合成多肽的各种定制修饰。 MS/MS 谱图用于确认合成多肽及其杂质的身份。 三氟醋酸比伐卢定 (Angiomax 或 Angiox，Medicines 公司生产)是具有20个氨基酸的合成多肽(凝血酶抑制剂)，能够可逆地抑制凝血酶。它用于治疗肝素诱导的血小板减少症并且预防血栓的形成。 比伐卢定的氨基酸序列为：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu(FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL)， 单一同位素质量数为 2178.9858 Da。 图1和2展示了比伐卢定多肽样品的分离谱图，其中使用 FA 作为流动相改性剂，并通过 UV 和 MS进行检测。 如表1所示， LC/MS/MS用于鉴定谱图中的几个主要杂质峰时，具有非常低的质量误差。常见的杂质包括缺失序列、插入序列、失水，并且在此多肽序列中， Asn可能会在生产或储存过程中发生脱酰胺基化。在 UV 谱图中可能遗漏一些强度较低的峰，例如杂质峰6，但是通过 MS检测，可以鉴定其为 Asn 之后额外增加了一个 Asn 的比伐卢定衍生物。 1.1. 1.0 0.9. 0.8 0.7<世 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 5 3 0.1 2 4 0 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.010.210.4保留时间 (min) 图1.比伐卢定多肽样品分离的 UV 谱图 ×108 图2.比伐卢定多肽样品的总离子流色谱图 表1.比伐卢定多肽和杂质的峰鉴定 峰 质量数(Da) 峰归属 目标质量数(Da) 质量数误差(ppm) 杂质1 2049.9467 Glu 缺失 2049.9432 1.71 杂质2 2049.9433 Glu 缺失 2049.9432 0.02 主峰 2178.9896 产品 2178.9858 1.74 杂质3 2121.9660 Gly 缺失 2121.9644 0.78 杂质4 2160.9764 失水 2160.9705 2.73 杂质5 2179.9741 脱酰胺基化 2179.9698 1.97 杂质6 2293.0306 Asn 插入 2293.0287 0.82 图3展示了杂质峰1((图3A)和2 ×105 (图3B)的代表性 MS谱图。杂质峰1和2都对应丢失了一个 Glu 的缺失序列。利用 MS/MS 谱图，我们可以确定峰1(图4A)对应缺失序列 E18del：FPRPGGGGNGDFEEIPEYL，碎片离子b15证实存在E14，碎片离子y4证实不存在E18。峰2(图4B)对应缺失序列E14del： FPRPGGGGNGDFEIPEEYL，碎片离子b4和b7可作为支持性证据。通过UV检测，可以计算比伐卢定多肽和杂质的峰面积及百分比用于定量(结果在表2中示出)。 图3.A)峰1的MS谱图；B)峰2的MS谱图 本研究为 LC/UV 和 LC/MS 工作流程开发了一种单一方法，使用 AdvanceBioPeptide Plus 色谱柱和流动相改性剂 FA进行合成多肽分析。在 LC/MS 和 LC/UV之间转移方法时可以节省时间和成本。 1.Eggen， l.； et al. Control strategiesfor synthetic therapeutic peptideAPls part III： manufacturingprocess considerations.Pharmtech.com 2014，38(5)， https：//polypeptide.com/web/upload/medias/1401700851538c41f34cef2.pdf 2. Hurteau， R. Separation of peptidestandards using formic acid as amobile phase additive (使用甲酸作为流动相添加剂分离多肽标准品)，安捷伦科技公司应用简报， 2017 3. Seybert， A. L.； Coons，J. C.；Zerumsky，K. Treatment of heparin-inducedthrombocytopenia： is there a role forbivalirudin? Pharmacotherapy2006，26(2)，229-241 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com ( 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ) 图4.A)峰1的MS/MS 谱图； B)峰2的MS/MS谱图 表2.比伐卢定多肽和杂质的UV定量 峰 峰面积 百分比(%) 杂质1 112.191 1.88 杂质2 77.235 1.30 产品 4825.859 81.06 杂质3 335.622 5.64 杂质4 103.816 1.74 杂质5 499.116 8.38 通常，使用 UV 检测的多肽色谱分离是通过 C18 柱以及三氟乙酸 (TFA) 改性的流动相完成，这种方法可以改善分离度，但同时会抑制质谱 (MS) 信号。甲酸 (FA) 是用于 MS 检测的首选流动相改性剂，但它可能会导致传统 C18 柱无法达到最佳分离效果。本应用简报介绍了通过单一液相色谱方法，采用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分离合成多肽杂质，并使用 UV 或 MS 进行检测。本方法使用 FA 作为流动相改性剂，可以提供足够的分离度以鉴定并定量多肽杂质。