草本茶中农药残留检测方案(液质联用仪)

红茶 绿茶红茶 优化样品前处理实现草本茶中农药残留的 LC/MS/MS分析 应用简报 食品检测和农业 作者 前言 Derick Lucas安捷伦科技有限公司 草本茶已深深融入到多种文化中，通常被认为能够改善身体健康状况，降低各种疾病的发生，例如癌症、中风和骨质疏松症等[1，2]。对茶的高需求量，要求实施现代化的农业生产方式，包括施用农药来维持茶收成的稳定。无论是允许还是禁止使用的农药，其最大残留限量越来越低，因此对草药制品中颇多种类农药的检测就需要快速、稳定且高效的方法[3]。该方法中至关重要的一步就是样品前处理，尤其针对植物性基质，它们往往非常复杂，且包含有干扰的基质化合物，导致离子抑制、共流出和仪器污染。 本研究采用快速、简便、经济、高效、耐用且安全的称之为 QuEChERS 的技术完成草本红茶和绿茶茶品的前处理。QuEChERS 包括如下三个简便的步骤：1)采用有机溶剂和分配剂盐进行萃取；2)采用吸附材料(分散吸附剂)进行样品净化；3)液相色谱或气相色谱分析，或两者均采用[4，5]。分散净化吸附剂包括 C18、N-丙基乙二胺 (PSA) 和石墨化碳黑(GCB)。对于包含大量色素的茶样品， GCB 的使用越来越重要；但必须谨慎使用，因为它也会移除目标分析物，尤其是具有平面结构的化合物。 采用 Agilent Bond Elut QuEChERS 预称量的试剂盒优化 QuEChERS 方法， 实现快速简便的方法开发。该方法可以充分净化高度着色的样品，大多数农药的回收率高，重现性好，平面结构农药没有明显的保留损失。 材料与方法 HPLC 级乙腈购自 Honeywell International， Inc.。反渗透水采用Millipore 水纯化系统制备。甲酸 (98%) 为 ACS 级， 购自 Sigma-Aldrich公司。茶样品来自多家供商商，由合作者友情提供。标样来自Accustandards 公司， 为浓度 100 pg/mL 的乙腈溶液。将它们混合并用乙腈稀释到适当浓度，储存在冷冻箱(-3C)内。 于离心管中加水10mL，加盖并涡旋1 min。样品彻底润湿后，将浓度50ng/mL的内标(乐果-d6、敌草隆-d6和二嗪农-d10) 乙腈溶液(10mL)加入离心管中，加盖，手动振摇1 min， 然后置超声水浴中超声 15 min。取出离心管，加入 Bond Elut QuEChERSOriginal 萃取盐 (4g MgS0 ， 1 g NaCl)， 然后将离心管手动强力振摇1 min。随后将样品以4000 rpm 的转速离心5 min， 实现水相和有机相溶剂的分离(图1，步骤1)。 样品前处理 分散固相萃取 萃取：适用于10g样品的 Agilent Bond Elut QuEChERS Original萃取管(部件部5982-5550) 分散 SPE 净化： Agilent Bond Elut QuEChERS 分散通用试剂盒，15 mL 分散 SPE 管 (400 mg PSA， 400 mg C18， 45 mg GCB，1200 mg MgSO)(部件号5982-0029) 过滤： Captiva Premium 注射式过滤器，尼龙膜，15 mm， 0.2 um(部件号5190-5088) 离心后，将6mL上层乙腈溶液转移到 Bond Elut QuEChERS 分散通用试剂盒的15mL离心管管。将离心管涡旋1min， 然后以4000 rpm 的转速离心 3 min。离心后，取2mL净化的萃取液加入10mL试管中，氮气流吹至近干。采用 0.7 mLH，0+0.1%甲酸 (FA)混合溶剂、0.2mL乙青，以及0.1 mL乙腈或校准标准液复溶样品。接着，将样品注射式过滤至自动进样器样品瓶中，用于LC/MS/MS分析(图1，步骤2)。 QuEChERS 萃取 称取干茶叶1±0.01g， 置50mL离心管中，按照要求给样品加标。 步骤1 QuEChERS 萃取 步骤2分散 SPE 净化 图1.绿茶和红茶萃取及净化的 QuEChERS 工作流程 液相色谱条件 色谱柱： Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18，2.1×150 mm， 1.8 pm (部件号959759-902) 表1为化合物分析的MS/MS参数，图2是所有加标浓度100 ppb农药的 MRM 叠加色谱图。 洗脱液： A： 水+0.1%甲酸 校准曲线和线性 B：乙腈+0.1%甲酸 进样量： 10 pL 流速： 梯度程序： 通过混合安部中的认证标准液来制备储备标准液。将储备标准液用乙腈适当稀释来制备工作标准液。溶剂复溶时，将适量的工作标准液加入入 QuEChERS 萃取的空白绿茶和红茶样品中，制备基质匹配的标样，浓度分别为0.5、1、5、10、20、50、100和200 ng/mL。 将三种内标加入所有样品，浓度 50 ng/mL， 并采用完整 QuEChERS 工作流程进行萃取。通过这些标样得到线性校准曲线，R?不小于0.992(数据未显示)。 柱温： 22 °C 仪器： Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪， Agilent 6410三重四极杆液质联用系统 质谱离子源参数 模式： ESI+ 干燥气温度： 300 °C 干燥气流速： 7L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 3500V 图2.本研究分析的红茶加标浓度 100 ppb的176种农药的叠加MRM 色谱图 结果与讨论 QuEChERS 萃取盐和净化试剂盒的选择 为了实现最高的回收率和重现性，本研究评价了几种萃取盐试剂盒。在测试了 Bond Elut QuEChERS Original、 AOAC 2007.01 和EN 15662 萃取盐后，我们发现包含1 g NaCl 和 4 g MgSO 的原萃取试剂盒可获得总体上最高的回收率。由于大量色素会与目标分析物一同萃取出来，因此，选择包含 GCB 的分散净化试剂盒是非常必要的。我们发现，使用包含 PSA、C18、GCB 和 MgSO，的 Bond Elut QuEChERS 通用试剂盒，可以获得明显更洁净的样品，以及更高的回收率，并且仅极小到中等程度地保留平面结构农药(多菌灵、噻菌灵、三环唑和嘧霉胺)。 回收率与重现性 对于绿茶和红茶基质中的176种农药，绝大多数使用本方法均可获得优异的回收率和重现性。对于绿茶样品，浓度10ppb 82%农药的回收率和浓度 100 ppb 92% 农药的回收率， 均在70-120%范围内。对于红茶样品，浓度10 ppb 76%农药的回收率和浓度100 ppb 88% 农药的回收率均在70-120%范围内。如图3所示，还有较少农药的回收率低于50%并且有一些农药未能检出。表2列出了全部农药以及各自的回收率和相对标准偏差。 110 图3.176种农药的回收率范围 表1.本研究中使用的化合物列表及其各自的 MS/MS分析参数 碰撞能量2(V) 碎裂电压(V) 保留时间 (min) 碎裂电压(V) 保留时间 (min) 保留时间 (min) 碎裂电压(V) 保留时间 (min) 表2.本研究中使用的化合物列表，以及它们在草药绿茶和红茶中的回收率和相对标准偏差 (RSD)(n=4)。 绿茶 红茶 10 ppb 10 ppb 100 ppb 100 ppb 10 ppb 10 ppb 100 ppb 100 ppb 化合物 回收率% % rsd 回收率% % rsd 回收率% %rsd 回收率% % rsd 霜霉威 46.6 6.0 52.0 8.7 63.1 17.6 56.0 5.7 灭害威 85.7 7.3 95.0 4.7 92.3 8.5 92.4 3.1 吡蚜酮 30.3 7.3 32.8 5.4 ND 10.0 9.8 高灭磷 80.5 5.2 85.7 4.2 99.7 3.2 91.5 2.7 甲胺磷 85.1 4.8 78.4 2.3 66.5 14.8 71.5 7.1 氧化乐果 81.7 11.4 91.6 7.4 83.4 4.4 89.5 4.7 涕灭威亚砜 73.7 14.2 85.0 7.3 92.8 13.8 82.5 3.6 多菌灵 95.9 12.6 85.1 8.9 67.2 8.4 73.9 6.1 噻菌灵 59.1 7.4 66.6 6.4 55.2 8.0 65.3 6.9 麦穗宁 71.9 2.0 84.5 2.0 67.8 6.0 77.6 4.1 自克威 81.6 4.2 95.5 3.5 124.7 17.5 94.9 8.8 烯啶虫胺 67.2 8.5 73.6 4.5 57.6 10.2 61.0 2.9 久效磷 100.1 6.2 82.9 4.4 103.2 6.4 81.5 9.5 丁酮砜威 91.7 7.6 99.2 5.4 89.9 11.5 110.3 6.0 涕灭威砜 88.9 2.3 105.7 6.9 95.4 5.9 98.1 3.1 百治磷 86.1 5.3 91.0 8.9 78.2 4.0 79.7 5.7 抗蚜威 ND ND 104.6 5.9 82.8 24.0 80.8 8.1 蚜灭多 95.6 15.1 91.2 7.5 72.2 5.1 90.2 4.5 噻虫嗪 87.7 5.0 88.9 7.7 79.0 5.5 85.6 7.6 双甲脒 21.8 21.5 31.4 8.2 ND 18.9 15.9 速灭磷 73.9 11.8 93.7 7.2 66.3 14.0 86.7 4.5 3-羟基克百威 ND 80.3 8.7 42.9 33.5 75.2 15.0 噻虫胺 104.4 16.1 99.8 12.5 71.6 11.0 104.3 3.0 密草通 90.5 1.6 95.4 9.3 87.2 7.4 89.8 7.7 扑灭通 86.9 6.5 96.5 8.7 89.6 5.0 89.0 4.2 特丁通 110.3 7.5 101.2 3.2 85.6 6.1 98.2 1.2 非草隆 82.8 9.4 93.1 7.1 83.6 6.5 91.5 绿茶 红茶 10 ppb 10 ppb 100 ppb 100 ppb 绿茶 10 ppb 10 ppb 100 ppb 100 ppb 100 ppb 10 ppb 10 ppb 100 ppb 100 ppb ND=未检出 结论 本文优化了 QuEChERS 样品前处理方法，实现对草本绿茶和红茶中176种农药的LC/MS/MS分析。在UPLC/MS/MS 平台上，该方法可以实现快速分离和高灵敏度检测。样品前处理可以充分净化高度着色的茶样品，并且大多数农药均可获得高回收率。 尽管 LC/MS/MS是农药残留分析的一款强大工具，但它并不适合分析适用于 GC 分析的某些类农药。将来的研究将探讨采用GC/MS/MS优化分析干燥植物基质中的农药。这些适用于 GC 分析的农药中，有一些可以被 GCB 吸附剂所保留，因此，必须小心权衡样品的净化与色素的清除，确保分析物达到一定的回收率。LC 和 GC工作流程的结合，将为绿茶和红茶中农药分析提供完整的解决方案，并且提供了可以进一步转换为分析其他高度复杂干植物基质的方法学。 ( 参考文献 ) ( 1. Y. T omata，et al.， Am. J. C lin. Nutr. 95，732 ( 2012) ) ( 2. T. M. Vance， et al.， Nutr. Cancer 65，793 ( 2 013) ) ( 3. D. Hayward， e t al.，Anal. Chem. 85， 4686 (2013) ) ( 4. M. Anastassiades， et al.， J. A0AC Int. 86， 412 ( 2003). ) ( 5. S. J. Lehotay， K . M astovska， A. R. Lightfield， J. AOAC Int. 88，615 & 60A (2005) ) 更多信息 这些数据代表典型结果。有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn www.agilent.com/chem/cn 安捷伦不对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2013 2013年12月17日，中国印刷 5991-3728CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies