癌细胞中对金纳米粒子的摄取率检测方案(等离子体质谱)

结果和讨论 应 用 报 告 电感耦合等离子体-质谱法 作者： Stefan Wilhelm 斯蒂芬森生物医学工程学院 俄克拉荷马大学 俄克拉荷马州诺曼 Ryan C. Bensen， Naga Rama Kothapalli， Anthony W.G. Burgett 化学和生物化学 俄克拉荷马大学 俄克拉荷马州诺曼 Ruth Merrifield， Chady Stephan 珀金埃尔默公司 加拿大伍德布里奇 介绍 癌症指的是异常细胞不受控制地生长和扩散的一种疾病。根据美国癌症协会的数据，癌症在美国最常见的死亡原因中排名第二。1目前治疗癌症的方法包括手术、放射疗法、免疫疗法、 化学疗法等。尽管这些传统治疗方法可能会提高患者的总体存活率和生活质量，但其还存在一些局限性。例如，在传统癌症化疗中，小分子癌症疗法以非特异性的方式将小分子药物分散至整个人体内。结果是，这些药物不仅杀死了癌细胞，还破坏了机体的健康细胞，给癌症患者带来严重的副作用，?因此迫切需要能够针对对变细胞的新疗法。 纳米粒子(NP)在过去的20年里引起了极大的关注，原因在于，其为药物递送提供了具有吸引力的优势，从而解决了传统化疗的局限性。3可将纳米粒子设计为同时携带药物和成像探针的模式，以便同时检测和治疗癌症。还可将其设计为专门针对机体病变组织和细胞的模式。很多基于纳米粒子的癌症疗法已获准在临床上使用和/或目前正在开发中。4.5与传统小分子药物相比，合理设计的纳米粒子具备以下优势的可行性：(i)延长体内循环时间；(ii)减少非特异性细胞摄取、意外偏离目标和副作用；以及(iii)通过特定癌细胞靶向部分来提高细胞相互作用。 癌症治疗的疗效与药物量有关，该药物量与每个单独癌细胞相互作用。用于测定药物暴露量的传统药物研究技术，例如，传统的电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，一直局限于细胞整体测量方法。然而，这些测试方法需要将给定细胞群均质化，以便进行定量分析。需要假设该细胞群中的所有细胞均相似，并假设这些细胞与相同数量的药物相互作用。相反，研究表明，细胞群属于异质，甚至来自同一细胞群和细胞系的细胞也存在差异。6例如，基因表达数据以均匀化细胞群为基础，将存在由于使用平均值数据结果，无法考量在单个细胞内发生的少量却关键的变化，而得出错误结论的可能性。单个细胞可能在大小、蛋白质水平、表达核糖核酸(RNA)转录上存在显著差异。这些差异是在讨论癌症研究、干细胞生物学、免疫学、发展生物学、神经学等以前无法解决的问题时，是非常关键的。 为解决分批处理细胞的试验方法造成的这些局限性，研究人员研发单细胞(SC)ICP-MS方法。该技术允许快速、可靠地分析大量单个细胞，而非分析作为整体或仅含少量细胞的细胞群。7研究表明，通过采用 SC-ICP-MS 方法，能够测定细胞内金属成分、定量分析金属及金属掺杂药物、纳米粒子的细胞摄取率。8-11 在本文中，我们证明了，在单个细胞基础上通过PerkinElmer 的 NexION2000单包胞 ICP-MS解决方案来量化癌细胞的金纳米粒子摄取量。该技术能够准确定量出含金纳米粒子(AuNP)的细胞数，辽能够分析每单个癌细胞中的 AuNP数，给出细胞群的摄取分布。 实验 样品和样品制备 按照 Perrault 和 Chan 的方法，通过晶种介导合成策略制备柠檬酸盐稳定剂的 50nmAuNP。12为了提高组织培养介质中的胶体稳定性，在室温下，采用5 kDamethoxy-terminated thiol poly(乙二醇)(USA，Laysan Bio， mPEGskDA-SH)， 在去离子(DI)水中按比例每个 AuNP 含 40，000mPEG-SH的分子浓度，将AuNP 聚乙二醇化。Malvern ZetaSizer Nano ZS、配备柯达2Kx2K 数字相机(该数字相机用于获取 AuNP)的电子显微图的日立 H-7600 透射电子显微镜(TEM)进行AuNP 动态光散射(DLS)实验。 从 ATCC (www.atcc.orq) 购买人类 T24 膀胱癌细胞。在组织培养处理过的培养皿上采用McCoy 5A培养基(补充10%FBS)， 将细胞培养为单层细胞。对于AuNP 摄取实验，在组织培养处理过的6孔板上，以每孔一百万 个细胞的密度接种T24 癌细胞，并在37℃(5% COz)的温度下培养24小时，以确保细胞粘附在培养皿表面。然后，在浓度为 0.4nM AuNP 的 McCoy 5A培养基(补充10%FBS)中，让细胞和50nm(纳米金颗粒直径)聚乙二醇化的 AuNP 接触4小时。接着，用1×PBS洗涤细胞五次，以酶促方式将其从组织培养皿表面分离，然后用4%多聚甲醛将细胞固定在1×PBS中，形成最终浓度为100，000个细胞/mL的单细胞悬浮液。 方法 通过表1所示条件，在 NexION 2000 ICP-MS 上运行Syngistix 软件下的单细胞应用模块，完成所有样品分析。图1显示了用于 SC-ICP-MS 分析的组件，包括 NexION2000 AsperonTM雾化室以及专用的单细胞进样微型 DX自动取样器。Asperon 雾化室旨在最大程度将细胞传送到 NexlON， 而单细胞微型 DX 自动取样器则在分析前搅动细胞悬浊液，以确保细胞不会从溶液中沉淀出来。 表 1. NexlON 2000 ICP-MS 仪器条件 参数/组件 值 雾化器 MEINHARD°高效雾化器 ( (HEN) 雾化室 Asperon 补偿气体(L/min) 0.7 雾化器气体(L/min) 0.54 等离子体功率(W) 1600 样品流速(uL/min) 10 自动取样器 单细胞微型 DX 搅动 单细胞微型DX自动取样器 样品环(uL) 50 纳米颗粒表征 根据已发表的方法，制备柠檬酸盐分散稳定的 AuNP胶体。12AuNP 胶体的透射电子显微图(图2)表明，其呈单分散状态，平均直径为50nm， 呈球形。通过 NexlON2000 ICPMS，单颗粒 ICP-MS (SP-ICP-MS)方法，进一步确定了这些纳米粒子的直径。该分析结果示于图3中。 通过 mPEG 5kDA-SH对柠檬酸盐稳定性 AuNP 进行表面改性，以提高组织培养基中的胶体稳定性，这些 AuNP 可用于纳米粒子细胞摄取实验。聚乙二醇化 AuNP 的动态光散射(DLS)实验表明，表面改性后流体动力学直径为79.9±2.3 nm，多分散指数(Pdl)为0.056(图4)。然而，TEM 和 SP-ICP-MS 结果类似，由于这些结果实际上均为测定AuNP的金属颗粒直径，因此DLS结果显示较大尺寸。DLS 结果以分散 AuNP 的布朗运动为基础，因此，结果包括围绕AuNP 的聚合物配体长度。这意味着 DL结果表明，考虑到流体动力学直径，NP尺寸更大。在去离子水中，这些聚乙二醇化 AuNP 的动电位接近中性(数据未显示)。 纳米颗粒特征实验确定 AuNP 呈单分散状态、胶体稳定且高质量，这是接下来通过 SC-ICP-MS 定量癌细胞摄取AuNP 的先决条件。 T24癌细胞摄取量 将人类 T24膀胱癌细胞用作癌细胞模型，以量化暴露于聚乙二醇化 AuNP 时的细胞纳米颗粒摄取量。采用 0.4nM 聚乙二醇化的 AuNP， 培养 T24癌细胞4小时。用1xPBS大量洗涤以去除多余的 AuNP后，用4%多聚甲醛将T24癌细胞固定，形成单细胞悬浮液。对于定量每个细胞的 AuNP 数， SC-ICP-MS 分析结果显示，每个细胞的AuNP分布范围为每个细胞摄取1到5个AuNP(图5)。 图3.根据单颗粒 ICP-MS(SP-ICP-MS)，分析金纳米颗粒的粒度分布。 图4.在法离子水中，聚乙二醇化 AuNP 的动态光散射 (DLS)特征。 聚乙二醇化 AuNP 的流体动力学直径为 79.9±2.3 nm (Pdl 为0.056)。 B 1.22 图5.通过 PerkinElmer NexlON 系统， 采用50nm(纳米金颗粒)聚乙二醇化 AuNP， 培养人类膀胱癌细胞4小时，随后进行 SC-ICP-MS 分析。(A)单个 T24细胞的金质量分布直方图一蓝色曲线强调了每个细胞含一个或多个 AuNP的细胞群。(B)细胞含一个或多个 AuNP (通常含一个 AuNP 的细胞数； n=3)的标准化频率分布直方图-条形柱表示标准差平均值。 SC-ICP-MS 分析为在单个细胞基础上定量癌细胞的 AuNP摄取量提供了分析方法。这种类型的数据独一无二，并且是传统整体 ICP-MS 方法无法获得的。结果表明，就每个细胞内的纳米粒子数而言，在使用传统消解方法时，AuNP 的摄取量并不均匀。通过传统 ICP-MS 方法制备均质细胞悬浮液，随后量化金含量，结果表明，每个癌细胞平均含1.5±0.1AuNP。然而，这一结果未提供单个细胞如何与 AuNP 相互作用的信息。 根据图5所示数据，合乎逻辑的下一步是，通过SC-ICP-MS，研究观察到的纳米颗粒于细胞分布的原因和潜在的生物学机制。换句话说，为什么某些细胞比其他细胞会摄取更多 AuNP? 这一点很重要，因为 AuNP 是很有前景的纳米材料，并且越来越多用于癌症治疗的诊断和治疗应用。4.13由于缺乏有效的分析工具，文献中关于 AuNP 如何与单个癌细胞相互作用的量化信息有限。通过量化单细胞(一次一个完整细胞)的细胞内元素浓度，SC-ICP-MS (一种允许将完整的单个细胞导入高灵敏度ICP-MS的技术)提供了获得这一重要信息的分析方法。 在本研究中，我们通过单细胞 ICP-MS分析方法，在单个细胞水平上定量癌细胞的 AuNP 摄取量。结果表明，每个细胞吸收的 AuNP 分布并不均匀，特定细胞群内的某些细胞比其他细胞明显摄取更多 AuNP。 SC-ICP-MS 是一个强大的分析工具，可在单个细胞水平上量化元素浓度和纳米粒子的分布。这项技术在单细胞基础上，具有提供的纳米粒子-细胞相互作用差异新见解的潜力。 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技技区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn ( 参考文献 ) ( 1. ht tp s：//www.cancer.org/c o ntent/dam / c an cer- o rg/ r esearch/ c anc er- fac ts-and-st a ti sti c s/a nn u al- c ancer-fac t s -a n d - f ig u re s /2018/ca nce r -f a c ts- a n d -f i gure s - 2 0 1 8 . p d f ) ( 2. L L ove，R . R.， Leventhal， H . ， Easterling， D.V.， and Nerenz， D.R.( 1 989). "Side e ffects and emotional distress during cancerchemotherapy."Cancer， 63(3)， 604-612. ) ( 3. P P eer， D.， Karp， J.M.， Hong，S.， F a rokhzad， O.C.， Margalit， R.，Langer， R. "Nanocarriers as an emerging platform for cancertherapy." Nature Nanotechnology 2， no. 12(2007)： 751 ) ( 4. S Shi， J. ， Kantoff， P.W.， Wooster ， R. ， and Farokhzad， O.C.(2017)."Cancer n a nomedicine ： pr o gress， challenges andopportunities" ， Nature Reviews Ca n cer， 17(1 ) ， 20. ) ( 5. V Wilhelm， Stefan， Tavares， A.J， Chan， W. "Reply to "E v aluation . of nanomedicines： stick t o th e basics " ." Nature Reviews Materials 1， no. 10 (2016) ： 16074. ) ( 6. M N agee， J.A.， P iskounova， E.， Morrison S.J. "Cancer stem cells：impact， heterogeneity， and uncertainty." Cancer Cell 2 1， no. 3 (2012)：283-296. ) ( 7. "Single Cell ICP-MS A nalysis： Quantification of Metal Content at the Cellular Level"， PerkinElmer， 2 017. ) ( 8. "Monitoring the Uptake of Nanoparticles and lonic/Dissolved Gold by Fresh W ater Algae using Single Cell ICP-MS"， P e rkinElmer， 2017. ) ( 9. "New R e search Evaluating Cisplatin U ptake in OvarianCancer Cells by Single Cell ICP-MS"， PerkinElmer， 2017 ) ( 10. ."Iron Content Measurement in Individual Bacterial CellsUsing SC-ICP-MS"，PerkinElmer， 2018. ) ( 11.N Merrifield， R. ， Amable，L.， Stephan， C." S ingle C e lICP-MS Analysis： Q uantifying the Metal Concentrationof Unicellular Organisms at the Cellular Level" ， Spectroscopy， 33 (6)， 33-39. ) ( 12. P P errault ， S.D.， and Chan， W.C . (2009) . "Synthesis andsurface modification of highly monodispersed， s p hericalgold nanoparticles o f 50-200 n m ”， Journal o f the American Chemical Society， 131(47)， 1 7042-17043. ) ( 13. Wilhelm， S.， T a vares， A.J.， D a i， Q . ， O h ta， S. ， Aud e t， J.，lDvorak， H.F. ， and Chan， W.C. (2016)."Analysis ofnanoparticle delivery t o tumours" ， Nature Reviews Materials， 1(5) ， 16014. ) 请访问 www.perkinelmer.com/ContactUs 查看我公司全球办事处的详单 方法通过表1 所示条件，在NexION 2000 ICP-MS 上运行Syngistix 软件下的单细胞应用模块，完成所有样品分析。图1 显示了用于SC-ICP-MS 分析的组件，包括NexION2000 Asperon™ 雾化室以及专用的单细胞进样微型DX自动取样器。Asperon 雾化室旨在最大程度将细胞传送到NexION，而单细胞微型DX 自动取样器则在分析前搅动细胞悬浊液，以确保细胞不会从溶液中沉淀出来。T24 癌细胞摄取量将人类T24 膀胱癌细胞用作癌细胞模型，以量化暴露于聚乙二醇化AuNP 时的细胞纳米颗粒摄取量。采用0.4nM 聚乙二醇化的AuNP，培养T24 癌细胞4 小时。用1xPBS 大量洗涤以去除多余的AuNP 后，用4% 多聚甲醛将T24 癌细胞固定，形成单细胞悬浮液。对于定量每个细胞的AuNP 数，SC-ICP-MS 分析结果显示，每个细胞的AuNP 分布范围为每个细胞摄取1 到5 个AuNP（图5）根据图5 所示数据，合乎逻辑的下一步是，通过SC-ICP-MS，研究观察到的纳米颗粒于细胞分布的原因和潜在的生物学机制。换句话说，为什么某些细胞比其他细胞会摄取更多AuNP ？这一点很重要，因为AuNP 是很有前景的纳米材料，并且越来越多用于癌症治疗的诊断和治疗应用。4,13 由于缺乏有效的分析工具，文献中关于AuNP 如何与单个癌细胞相互作用的量化信息有限。通过量化单细胞（一次一个完整细胞）的细胞内元素浓度，SC-ICP-MS（一种允许将完整的单个细胞导入高灵敏度ICP-MS 的技术）提供了获得这一重要信息的分析方法。结论在本研究中，我们通过单细胞ICP-MS 分析方法，在单个细胞水平上定量癌细胞的AuNP 摄取量。结果表明，每个细胞吸收的AuNP 分布并不均匀，特定细胞群内的某些细胞比其他细胞明显摄取更多AuNP。SC-ICP-MS 是一个强大的分析工具，可在单个细胞水平上量化元素浓度和纳米粒子的分布。这项技术在单细胞基础上，具有提供的纳米粒子- 细胞相互作用差异新见解的潜力。