卵巢癌细胞中对顺铂的摄入情况检测方案(等离子体质谱)

仪器 结论◎2017， PerkinElmer， Inc. 版权所有。保留所有权利。PerkinElmer 是 PerkinElmer， Inc. 的注册商标。所有其他商标均为其各自所有者的财产。所有解释权归PerkinElmer.013176_CHN_01 PKI 最新研究进展-——利用单细胞电感耦合等离子体质谱评估卵巢癌细胞对顺铂的摄入 引言 在西方国家，顺铂，卡铂和奥沙利铂是使用最 广泛的铂类癌症化疗药 物。卡铂的有效性是由于其可以与 DNA 结合从而导致 DNA-铂(Pt)加合物的形成，但这也会造成 DNA 的弯曲。因此在化疗后细胞必须修复 DNA 损伤，否则 DNA 复制受阻会导致细胞死亡。 许多癌症患者最初对基于铂类的治疗比较敏感，但一段时间后，患者通常对顺铂治疗表现出耐药性，导致了癌症的复发。顺铂耐药性归因于三种主要的分子机制： DNA修复的加速，胞浆失活的加速和细胞摄取药物能力的变化。其中，细胞摄取药物能力的变化主要表现在细胞对顺铂的摄入能力降低或者顺铂转运的加速。 细胞内顺铂的摄入与肿瘤负荷相关，也就是说肿瘤对寸顺铂反应降低会导致细胞内顺铂的含量降低。所以，分析单个细胞水平对顺铂的摄入和分布对于评估治疗的有效性具有非常重要的意义。过多顺铂进入细胞内会增加 DNA 损伤和细胞死亡的频率。，了解细胞对顺铂的摄入将能为新疗法的开发提供参考，以提高肿瘤对顺铂的敏感性。 如图1所示，研究顺铂摄入的首要问题是设计出合适的分析方法。传统方法是，将细胞群置于顺铂培养液中，然后测定细胞群内铂的总量：先将细胞消解，然后通过原子吸收光谱 ((AAS)或者电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等技术检测铂的浓度。然而，浓度的意义并不明确，从而导致了一些问题： 在细胞水平上，这个浓度的含义是什么? 是否所有细胞都具有同样的细胞内顺铂浓度? 是否一些细胞具有高浓度的顺铂而另一些只有低浓度或者没有顺铂? 传统方法的缺陷在于铂的浓度只反映整体细胞群内的浓度而不是个体细胞内的浓度。因此，顺铂摄入在个体细胞之间的分布和差异无法通过传统方法体现。实际上，细胞对顺铂的摄入最有可能根据个体有很大差异，但至今还没有有效的方法来评估。 图1.细胞群顺铂摄入的各种可能性 本文介绍了一种全新的技术，可对金属在单一细胞水平上进行定量：单单胞电感耦合等离子体质谱(SC-ICP-MS)。SC-ICP-MS 是以单颗粒电感耦合等离子体质谱(SP-ICP-MS)技术为基础，后者能够在溶液中对纳米粒子进行评估与定量。两种技术都基于测量单个细胞(或单个纳米颗粒)在进入等离子体时产生的离散信号的原理。每个细胞中的金属成分离子化，产生离子流，检测器以每秒100000数据点的速度快速对信号采集测量，从而使得单个细胞中的金属含量能被定量到阿克(ag)/每细胞的水平。相比测量细胞内顺铂摄入的传统方法， SC-ICP-MS 所得结果的信息量更加全面。 本文介绍了利用SC-ICP-MS 来研究单个细胞水平下的顺铂的摄入行为。 实验部分 细胞的培养和顺铂处理 所有实验使用卵巢癌细胞为A2780 和A2780/CP70细胞系。细胞生长温度为37℃， CO，浓度低于5%，使用RPMI1641 培养基 (Gibco TM)， 含有10%胎牛血清(FBS，Gibco TM))，胰岛素(Sigma-AldrichTM))，，L-谷氨酰胺(Gibco TM)和青霉素-链霉素(Gibco TM)。在血清饥饿试验中，细胞铺板并允许附着。大约18小时培养后移除培养基并以无血清培养基更换，之后再更换成普通培养基，并开始用顺铂处理。在加入培养基前，顺铂被分散在 1mg/mL的无菌盐溶液中并用力摇匀30分钟。图2显示了样品预处理的流程图。细胞在30uM的顺铂中培养，在第1，2，4，8小时后采集样本。分析前，细胞用磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗两次并使用非酶细胞解离液Cellstripper (Corning TM) 收集。细胞以500g离心10分钟。然后弃去上清液，将细胞重新分散于 1mL PBS中，用一张70um尼龙网布过滤并使用血细胞计数器计数定量。上机前，细胞用 PBS稀释到最终浓度 (100000cells/mL) 并在进样前于冰上冷冻保存。 分析使用珀金埃尔默公司的 NexION电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS)，结合Syngistix TM单细胞应用软件模块进行数据采集和处理，如图3所示。仪器条件如表1所示， NexlON 在使用前会被调谐到最佳状态和灵敏度。使用单细胞专用进样系统(货号N8150031)进行细胞进样。该进样系统包括一个高效雾化器(货号N8142046) 和专利的Asperon TM雾室(货号N8152493)，此雾室专为等离子体细胞进样而设计，优化了传输方式。由于细胞(尺寸1-100um)大于常规雾化器产生的液滴((<2um)，所以细胞进样必须使用这种专用雾室。 铂离子标准溶液介质为 PBS， 基体与细胞样本匹配。标准曲线的浓度为1，2， 3 ppb 的铂标准溶液。进样效率由在 PBS中的60 um金纳米颗粒确定。 结果与讨论 本文中选择的细胞是卵巢癌细胞系A2780 和A2780/CP70，是对建立单细胞方法而言较好的模型，因为其耐药分子机制是随顺铂摄入行为而改变的。A2780 是顺铂敏感细胞系，而A2780/CP70 是顺铂耐药型。其耐药性是通过将A2780 亲本细胞系暴露在剂量增加的顺铂下实现的。A2780/CP70 细胞通过降低顺铂摄入和增加 DNA修复产生耐药性。 参数 值 进样速率 0.04 mL/min 雾化器 MEINHARD@ HEN 雾室 Asperon 中心管 内径2.0毫米石英中心管 射频功率 1600W 雾化气流量 0.36 L/min 辅助气流量 0.7 L/min 铂同位素 195 amu 驻留时间 50 ps 样品分析时间 60s 细胞对顺铂的摄入可利用时间过程实验来研究，即分析顺铂在细胞群内的分布如何随时间变化。将两个细胞系置于30uM顺铂培养液中1，2，4和8小时。分析过程中，操作软件可给出两个实时图：一个显示强度响应与细胞数量，另一个将这些数据转换为一个柱状图，表明每细胞内质量数与响应频率之间的关系。这两个图如图4所示。在数据收集完成后，质量分布的峰值可以被整合，如图4第三个图所示。 两个细胞系对顺铂摄取与时间之间的关系如图5所示。在一小时顺铂处理中，两个细胞系都表现出非常少量的铂摄取。随着时间的推移，两个细胞系的细胞都摄取越来越多的顺铂并表现出差异性分布。顺铂处理八小时后，A2780 和A2780/CP70细胞系中，有一部分细胞比剩余部分的细胞含更少的顺铂。此外，八小时后细胞系之间 也存在显著差异，相比A2780/CP70， A2780 细胞系里越来越多的细胞含有更多的顺铂。这些结果与之前文献中观测到的结果一致，即A2780细胞能比顺铂耐药细胞系A2780/CP70积累更多的铂‘。 图4.SC-ICP-MS 实时分析暴露在顺铂下的单细胞：(A)信号读取次数与信号强度之间的关系；(B)信号峰面积与频率之间的关系柱状图； 图5.随着时间推移细胞 A2780 和A2780/CP70 的顺铂摄入。注：横坐标尺度不同 时间进程数据是通过对每个柱状图正态曲线进行对数拟合得到的。在时间进程下A2780 和A2780/CP70细胞顺铂摄入的差异与时间的关系见图6所示。与顺铂耐药细胞A2780/CP70 相比，A2780 随时间推移能摄入更多的顺铂。 为了判断顺铂摄入的差异性分布是否归因于细胞周期的不同，细胞进行了血清饥饿实验。当细胞在组织培养基中生长时，培养基内通常是以不同速度生长的细胞的混合物，这会导致各种细胞处在不同的细胞周期阶段，如图7所示。细胞周期的四个部分被称为G1， S， G2和M。G1阶段是第一个阶段(通常也是最长的阶段) 接着是Ｓ阶段，在此阶段 DNA 被合成和复制，为细胞分裂做准备。随后是 G2生长阶段，之后是M阶段(有丝分裂)，，在此细胞分裂成为两个细胞。因此，顺铂水平的差异可能是由于细胞周期阶段的不同导致的。通过细胞血清饥饿实验，生长因子从介质中移除，细胞被停滞在 G1阶段。 重复顺铂摄入的时间实验，用来比对血清饥饿和对照细胞摄入的差异性。图8为血清饥饿实验的结果，其中平均强度用每个时间点的强度平均值表示。此结果表明血清饥饿不论对 A2780 还是 A2780/CP70 细胞系在顺铂摄入上都没有影响，两者与对照细胞相比都表现相似的顺铂摄入率。因此，结果表明胞内顺铂摄入的差异性分布不是由于细胞周期而是其他不明机制造成。 图6.时间进程下每个细胞系的铂平均强度与时间的关系，结果是由n=3的独立实验结果汇总而成，并根据平均数±标准差绘制成图 图7.细胞生长周期阶段： G1是第一生长周期，S是 DNA 合成和复制周期， G2 是第二生长周期，M是有丝分裂周期 SC-ICP-MS是一种在单细胞水平上稳定测量铂的方法。本文利用卵巢癌细胞系A2780 和A2780/CP70表征了随着时间增加顺铂的摄入有所增长。相比A2780 敏感细胞系，顺铂摄入在耐药性的 A2780/CP70细胞系上水平降低。顺铂摄入的细胞差异性不是由于细胞周期的不同，因为血清饥饿细胞并不改变顺铂的整体摄入。顺铂摄入的胞内差异性是由于其他尚未确定的因素造成的。 SC-ICP-MS 不仅是个体细胞内顺铂定定量方法，并且是一个在细胞群内分析顺铂摄入的更好的方法。顺铂摄入行为在细胞群里是有差异的，细胞与细胞之间不同，这或许更清楚地反映了在肿瘤中发生了什么。 利用 SC-ICP-MS 对细胞摄入顺铂的行为进行分析，是一种全新的表征细胞对顺铂摄入和排出行为的方法，为增加细胞摄入打下了基础。 ( 参 考文 献 ) ( 1. Amable L. ( 2016) Cisplatin resistance and opportunities for precision medicine. Pharmacol R es. 1 06：27-36. ) 2. Parker R.J. Eastman A. Bostick-Bruton F. Reed E.(1991) Acquiredcisplatin resistance in human ovarian cancer cells is associatedwith enhanced repair of cisplatin-DNA lesions and reduced drugaccumulation.J Clin Invest. 87(3)：772-7. 耗材与试剂 耗材与试剂 描述 货号 进样管 橙/红(0.38mm内径)， N0773111 PVC，扩口，一包12根 排液管 灰/灰(1.30mm内径)， N0777444 山都平，一包12根 铂((Pt)标准储备液 1000 ppm Pt， 125mL N9303791 60 nm 金(Au) 红 纳米颗 2.60E+10 particles/mL， 25 N8142303 粒标准溶液 mL 15mL，一箱500根 B0193233 定量管 50mL，一箱500根 B0193234