辅料中生物制剂检测方案(液相色谱仪)

+ 仪器平台二 Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE， 目录 01 生物制剂中药用辅料基本介绍 01 前言 01 生物制剂中常用药用辅料介绍 07 应用案例 07 使用UPLC H-Class/ELSD 系统对生物制剂中的吐温80进行定量测定 09 使用ACQUITY Arc/2424 ELSD系统定量测定高浓度蛋白制剂中的吐温20 11 使用ACQUITY UPLCH-Class/QDa系统定量测定蛋白制剂中吐温20 13 使用ACQUITY Arc/QDa系统测定注射液中泊洛沙姆F68的含量 15 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统进行聚丙二醇定量分析 17 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统定量测定蛋白制白中的组氨酸、精氨酸 19 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统定量测定蛋白制剂中的蔗糖、甘露醇 此文集收录沃特世实验中心建立的生物制剂辅料含量的测定方法，供大家参考 药用辅料系指生产药品和调配处方时使用的赋形剂，包含那些具有控制药物释放、传递功能的物质和可能在制剂工艺过程中加入但标明要求去除的物质；是除活性成分或前体以外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且含在药物制剂中的物质。 生物制剂中常用的药用辅料 溶剂/助溶剂/乳化剂-“吐温”““泊洛沙姆” 吐温20(Tween-20)，又名聚山梨酯20，为淡黄色粘稠液体，溶于水、乙醇、油脂等，是一种非离子型表面活性剂，常用作生物制剂中的乳化剂，能够在不破坏蛋白结构的同时减少蛋白间原有的相互作用。由于吐温有可能导致的不良反应，且含量的高低与不良反应的发生和程度存在相关性，所以需要对添加的吐温20含量进行严格的控制测定。 吐温80(Tween80)，又名聚山梨酯80。为淡黄色粘稠液体，溶于水、乙醇、油脂等，由于其结构中具有较长的碳链结构，对药物有较好的助溶作用，常用于做注射剂的增溶剂，当临床长时间或超剂量使用时，就有可能出现溶血等副作用。同样需要对添加的吐温80含量进行严格的控制测定。但吐温结构复杂，定性定量较为困难。 泊洛沙姆是一类新型的高分子非离子表面活性剂。作为药用辅料已经被中国药典和国外药典收藏。作为增溶剂，近年来逐步被使用。 132种增加至270种，呈现递增趋势，且在这270种药用辅料中包含一些常见但以前关注程度较少的辅料，例如吐温、PEG、泊洛沙姆等药用辅料也被收录到2015版药典中。 为确保药用辅料的安全，2015版药典药用辅料标准的 消泡剂-“聚丙二醇” 聚丙二醇，透明、无色或基本无色的粘稠液体。不挥发，溶于水(低分子量者)和脂族酮和醇类等有机溶剂，不溶于乙醚和大多数脂族烃类。最突出的特性是它具有与各种溶剂的广泛相容性，广泛的粘度范围和吸湿性。可用于药剂。相对分子量较低的聚丙二醇可用作溶剂、助溶剂、o/w型乳化剂和稳定剂，用于制作水泥悬剂、乳剂、注射剂等。 稀释剂-“蔗糖、乳糖、甘露醇” 注射剂中的附加剂种类较多，其主要作用是保持药液稳定，减少对人体组织的刺激。常用的附加剂有保护剂(如蔗糖、乳糖)等，冻干制剂中的赋形剂(如甘露醇或山梨醇)等。 蛋白保护剂-“氨基酸” 在蛋白药物注射剂中常用的药用辅料，，.主要增强抗氧效果，但用量较大时也具有一定的药理活性。比如药用辅料甘氨酸的用量不宜过大(稳定剂用量不超过1.5g)，超过了甘氨酸的起效剂量，可认为本处方中甘氨酸会产生药理活性，因而需要对处方中的甘氨酸含量进行严格的控制。 仪器平台一 ACQUITY Arc系统简介 ACQUITY Arc系统是一套具有四元溶剂管理器的现代液相色谱系统，用以填补HPLC和UPLC之间的性能差距，适用于在使用现有方法进行方法转换的科学家们。 重现现有的方法： ACQUITY Arc 系统采用了全新的Arc Multi-flowpath 技术，可以让用户根据原有方法，选择不同的系统延迟体积，从而在HPLC 和UHPLC 之间轻松实现方法转移或转换。 Auto·Blend Plus技术： 利用Auto·Blend Plus 技术可利用纯溶在在线自动调节所需的pH值和缓冲溶液浓度，避免了烦琐的的手动配置、混合流动相，并减少人为误差，节省时间，提高了实验室效率，同时保证不同实验室方法转移的重现性。 极低的交叉污染： 样品管理器的FTN模式可在梯度运行中，用流动相冲洗针内壁，降低交叉污染。 灵活的色谱柱管理： 使用集成的预加热选项，提供统一、恒定的温度，以确保实验室之间方法的重现性。可选配的集成式色谱柱选择阀可实现快速、自动的色谱柱切换。 支持的软件： Empower 3和MassLynx软件 AcouityH ACQUITY QDa质谱检测器 UPLICCLASS ACQUITY UPLC H-Class系统简介 ACQUITY UPLC H-Class系统是唯一是款旨在提供真正的UPLC性能的四元液相色谱系统。无论是新方法开发还是日常高通量样品分析， ACQUITY UPLC H-Class系统都能助力实现更高的分离度，更快的分析时间，降低成本。 其功能和优势如下： 极低的系统延迟及扩散体积：ACQUITY UPLC H-Class 系统是扩散体积和延迟体积最小的四元LC系统，从而获得最高的灵敏度和最佳的分离度，降低分析时间，降低成本。 使用Auto·Blend Plus 技术：利用Auto·Blend Plus 技术可在线自动调节所需的pH值和缓冲溶液浓度，避免了烦琐的的手工配制、混合流动相，并减少人为误差，节省时间，提高了实验室效率，同时提高方法在不同实验室的重现性。 智能的SmartStart 技术： 可在方法里设置梯度开始的时间(进样时，进样前和进样后)，可以有效避免方法转移时，由于不同系统间延迟体积的差异而产生的色谱峰RT的差异。 极低的交叉污染： 样品管理器的FTN模式可在梯度运行中，用流动相冲洗针内壁，降低交叉污染。 支持的软件：Empower 3、MassLynx 当被分析物没有UV/Vis 吸收，或在质谱仪中不离子化时， ELSD可用于分析此类化合物分子(包括糖类、甘油三酸酯、磷脂、及天然产物)。 其功能和优势如下： 可与其它检测技术一同使用，分析更全面，保证对样品中的所有组分进行检测。 雾化、蒸发和检测阶段的精确温度控制，在提高分离度的同时保持低扩散性，并提供可重现的结果。 体积小、、可堆叠的摆放方式、最大限度减少对实验室空间要求。 检测到气压较低时，传送停流速的信号到LC系统。 ACQUITY QDa质谱检测器的推出是Waters将色谱和质谱技术完美融合的一项重大突破，，其能够在现有色谱工作流程的基础上增加质谱的数据，为实验室分析工作带来一个全新维度。 其功能和优势如下： 可以获得更多信息： ACQUITYQDa 谱谱检测器提供的质谱数据是对光学检测器数据的有效补充，特别是对于共流出或光学检测器没有响应的组分。 可以使用质谱数据，提高定量限，特别对于没有光学信号的化合物：当所分析化合物与其他化合物有共流出或光学检测器没有响应时，，可以使用ACQUITY QDa 提供的质谱数据，进行定量，提高灵敏度。 方便易用： ACQUITY QDa 质谱检测器如同光学检测器一样直观易用，一键启动，快速抽真空，并自动实现质量数的校正。 支持的软件： Empower 3和MassLynx软件。 吐温、聚丙二醇 +T 吐温20、吐温80、聚丙二醇都属于聚合物，其结构复杂，含有较多亲水基团，无强发色基团，常规LC-UV 无法进行精准的定性分析。同时吐温是不均匀混合物，定量具有挑战性。本文尝试的蒸发光散射检测器(ELSD)和QDa质谱检测器为吐温、聚丙二醇的定性定量提供了一个理想的检测手段。 解决方案 色谱柱的选择 编号 键合相 粒径 规格 部件编号 1 Oasis° MAX 30 um 2.1x20mm 186002052 2 XBridge Cig Direct Connect HP 20um 2.1x 30 mm 186005232 表1.推荐用于吐温、聚丙二醇方法开发的色谱柱。 色谱柱选择策略 生物制剂中中有蛋白浓度较低(如蛋白含量10 mg/mL)， 推荐选用Oasis MAX色谱柱， Oasis MAX柱是一款在线样品前处理柱，样品可过滤后直接进样分析测定。 生物制剂中含有高浓度的蛋白(如蛋白含量150 mg/mL)， 推荐选用XBridge Cg Direct ConnectHP色谱柱，样品上样之前需要对样本做蛋白沉淀前处理，离心后取上清液进样分析测定。 检测器的选择(ELSD or QDa) 当生物制剂中蛋白药物浓度过高，需要使用蛋白沉淀除去高浓度蛋白以避免干扰；这时样品至少被稀释4倍，此时， ELSD 的灵敏度不能满足需求，需要使用灵敏度更高的单四极杆QDa检测器进行定量分析。 流动相 流动相A：：水-含有2%甲酸 流动相B：异丙醇-含有2%甲酸 Wash溶液：50/50水/异丙醇 Purge溶液：50/50水/异丙醇 Seal wash溶液：90/10水/乙腈 样品前处理 蛋白药物浓度较低时，采用Oasis°MAX柱，样品无需前处理，可以过滤后直接进样。蛋白浓度较高时，采用XBridge Cig Direct Connect HP柱，需要先把样品做蛋白沉淀，取上清液进样。 糖常作为附加剂添加到注射剂中，其主要作用是保持药液稳定，减少对人体组织的刺激。常用的附加剂有保护剂(如蔗糖、乳糖、麦芽糖)等，冻干制剂中的赋形剂(如甘露醇或山梨醇)等。 由于糖类的自身理化性质的特殊性，结构中缺少发色基团，并且各种分子间结构非常相似，其中许多互为异构体。检测通常采用RI(示差检测器)或ELSD。而采用RI检测器只能运行等度，使用流动相需谨慎，往往需要数小时才能平衡。ELSD相对更可靠， 但ELSD常常无法实现复杂基质中检测糖所需要的灵敏度。而质谱检测器ACQUITY QDa 则可降低检测限，并且能够获取各组分质谱信息。运用ACQUITY UPLC/QDa 系统，结合ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱的分离，成功建立了葡萄糖、蔗糖、甘露醇等糖的测定方法。 解决方案 色谱柱的选择 编号 键合相 粒径 规格 部件编号 1 ACQUITY UPLC BEHAmide 1.7 pm 2.1x100 mm 186004801 表2.推荐用于单糖、双糖方法开发的色谱柱。 色谱柱选择策略 因为糖的结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象，而Waters这款BEH Amide色谱柱使用化学稳定的、三键键合的酰胺基键合相，不易生成Schiff碱，允许使用高pH和高温条件以合并还原糖差向异构体的岔头峰，使定量更准确，缩短分析时间。 流动相 流动相A：乙腈/水/异丙醇(90：5：5)含有500ppb盐酸胍和0.05%二乙胺流动相B：乙腈/水(80：20)含有500ppb盐酸胍和0.05%二乙胺 样品前处理 一般生物制剂辅料中糖的含量都很高，在测试之前先将样品用水稀释，再用50%乙腈水溶液稀释至标准曲线的线性范围之内。 在注射剂生产中常用作助溶剂，增加药物溶解度，减少药物的副作用，但用量较大时也具有一定的药理活性。因此对药用辅料中的氨基酸进行准确的定量分析也是必不可少。 由于许多氨基酸不含发色团，并且极性都比较强，常规的反相色谱柱很难保留，这进一步增加了采用LC的方法对其进行分析的复杂性，因此我们采用ACQUITY UPLCBEH Amide 色谱柱，运用ACQUITY UPLC/QDa 系统，成功建立了组氨酸、精氨酸等氨基酸的测定方法。 色谱柱的选择 编号 键合相 粒径 规格 部件编号 1 ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 pm 21x100 mm 186004801 表3.推荐用于氨基酸方法开发的色谱柱。 色谱柱选择策略 因为氨基酸类化合物的极性都比较强，常规的反相色谱柱很难保留， ACQUITY UPLC BEH Amide是一款亲水作用色谱柱，使用化学稳定的、三键键合的酰胺基键合相，可以对极性分析物实现优异的保留与分离。 流动相 流动相A：水-含有0.1%甲酸 流动相B：乙乙-含有0.1%甲酸 m 相样品前处理 样品前处理无需衍生化。一般生物制剂辅料中氨基酸的含量都很高，在测试之前先将样品用水稀释，再用70%乙腈水溶液(含有0.1%甲酸)稀释至标准曲线的线性范围之内。 使用ACQUITY UPLC H-Class/ELSD系统对生物制剂中吐温80进行定量分析 样品前处理方法 生物制剂液体样品0.2um水脂两用型滤膜过滤进样。吐温80配制不同浓度标准曲线：0.01，0.05，0.1，0.2， 0.5 mg/mL，直接进样 仪器型号LC System ACQUITY UPLC H-Class；ACQUITY ELSD； 控制软件Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column Oasis MAX， 2.1x20 mm， 30 um，部件编号：186002052 流速(mL/min)Flow Rate 1.000 柱温(℃)Column Temperature 30 流动相 Mobile phase A：水(2%甲酸) B：异丙醇(2%甲酸) ELSD参数 增益值 气体压力(psi) 漂移管温度(C) 喷雾器模式 200 20 55 Cooling QDa参数 离子源 MS Scan m/z (Da) 毛细管电压(kV) 锥孔电压(V) ESI(+) 600-1200 1 15 ESI(+) ELSD定量结果 图2.吐温80线性图。 化合物 线性范围(mg/mL) 相关系数(R) 定量下限(mg/mL) 吐温80 0.01，0.05，0.1，0.2，0.5 0.9981 0.01 表1.线性试验结果。 样品实际含量(mg/mL) 加标测定值(mg/mL) 回收率 Buffer+0.1mg/mL 0.01 0.118 108% 样品1+0.1mg/mL 0.103 0.227 114% 样品2+0.1mg/mL 0.110 0.225 105% 表2.吐温80加标回收率结果。 结论 本实验中，使用ACQUITY UPLC H-Class与蒸发光散射检测器(ELSD)用于确定制剂样品中的吐温80的浓度。运用混合模式Oasis MAX色谱柱，酸性异丙醇和水为流动相，在配备流路切换阀的ACQUITY UPLC色谱柱管理器上，将酸性条件下在MAX柱上不保留的蛋白组份切至废液，后在吐温出峰时间改变阀位置将吐温定向洗脱到ELSD准确定量。 结果表明，吐温80的线性范围为0.01 mg/mL-0.5 mg/mL， R²=0.9981，线性关系良好；做加标回收率，其加标回收率结果均在±15%以内。 应用ACQUITY Arc/2424 ELSD系统定量测定高浓度蛋白制剂中的吐温20 样品前处理方法 生物制剂液体样本用3倍体积的乙腈去沉淀蛋白，14000 rpm离心5分钟，取上清进样 仪器型号LC System ACQUITY Arc； 2424ELSD 控制软件Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column Oasis MAX， 2.1x20 mm，30 um，部件编号：186002052 流速(mL/min)Flow Rate 1.200 柱温(C)Column Temperature 30 流动相 Mobile phase A：水(2%甲酸) B： 异丙醇(2%甲酸) 2424ELSD参数 增益值 采样速率 时间常数 气体压力 喷雾器模式 漂移管温度 100 2 pps 慢速 25 psi 加热，75% 80°C 10 mg/mL 吐温20容品溶液用水稀释成以下5个浓度测标准曲线150、300、600、900、1200 ug/mL，线性范围150-1200 ug/mL， R’=0.9993 信言比： 150 ug/mL 浓度标准品， s/n=87.5 E Name RetentionTime(min) Area(pV*sec) s/n 1 Tween20 4.127 17299 87.4 LLOQ重现性考察 样品连续6针进样的重复性谱图如下，通过计算峰面的RSD小于1.9% 样品测定结果谱图 如果样本含蛋白浓度过高的话， Oasis MAX色谱柱饱和不能完全除去样品中的蛋白，未除去去蛋白会严重干扰吐温20的定量。例如本次样本蛋白浓度为150 mg/mL， 此蛋白浓度下的羊本不做前处理直接进样色谱图左图所示。 样本用3倍体积的乙腈沉淀蛋白，14000rpm离心5分钟，取上清进样，色谱图如左图所示，吐温20出峰位置无蛋白干扰。 结论 借助于UPLC技术， Oasis MAX柱成功地保留吐温20的样品，采用2424 ELSD成功定量样品中的吐温20， LLOQ、样品连续6针进样的重复性计算峰面积的RSD分别为1.7%、1.9%，表明该方法重现性好。 如果样本含蛋白浓度过高的话， Oasis MAX色谱柱饱和不能完全除去样品中的蛋白，未除去的蛋白会严重干扰吐温20的定量。样本用乙腈去沉淀蛋白，14000 rpm离心5分钟，取上清进样，可消削蛋白对吐温20定量的干扰。 注意事项，当发现基线升高或者在运行完一个序列后，建议及时清洗ELSD， 清洗步骤如下： m在控制台中打开ELSD检测器。 m设置气体流速为30-40 psi。喷雾器下拉菜单选择“开”，并输入数值75%。 设置漂移管温度为90摄氏度。 取下色谱柱，换上两通。用100%HPLC级的水冲洗20-30min， 再用100%甲醇冲洗20-30min。运行2-3个循环。 将流速设置为0，烘检测器30min。 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统定量测定蛋白制剂中的吐温20 样品前处理方法 蛋白制剂用水溶解后，用4倍体积的乙腈去蛋白沉淀样品，离心后取上清液进样 仪器型号LC System ACQUITY UPLC H-Class；ACQUITY QDa 控制软件 Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column XBridge Cig Direct Connect HP， 2.1x 30 mm，20 pm，部件编号：186005232 流速(mL/min)Flow Rate 0.600 柱温(℃) Column Temperature 45 流动相 Mobile phase A：水(2%甲酸) B：异丙醇(2%甲酸) QDa参数 离子源 MS Scan m/z 毛细管电压(kV) 锥孔电压(V) 采集频率(HZ) ESI(+) 300-1250 1.2 20 QDa 谱图 QDa 结果 吐温20提取m/z(658.6+680.6+702.7+724.7+746.8+768.8+790.8)通道，QDa质谱检测器测试吐温20XIC图及吐温20光谱指数图，如下图所示： 线性范围7 pg/mL-400 pg/mL， R’=0.9949 QDa 定量限(7 ng/mL) QDa 重现性结果 样品连续进样6针峰面积的重现性RSD为2.9% Date AoQulnd. 1/23/20142.4349PMCSTPeak Summary with StatisticsName： TW20Time (min) SampleName Vial Inj Name RetentionTime (min) Area 1 S*2 2：B，7 1 TW20 2.362 1659059 2 S*2 2：B.7 1 TW20 2.360 1598623 3 S*2 2：B，7 1 TW20 2.362 1699484 4 S*2 2：B.7 1 TW20 2.363 1698707 5 S*2 2：B，7 1 TW20 2.360 1617221 6 S*2 2：B，7 1 TW20 2.365 1717769 Mean 2.362 1665144.0 Std. Dev. 0.002 48649.2 % RSD 0.07 2.9 本次实验采用QDa单四极杆质谱检测器通过提取吐温20特有的离子通道(XIC)对样品辅料吐温20进行准确的定量分析，该方法灵敏度好，线性范围宽(7 ug/mL-400 pg/mL， R=0.9949)，完全满足生物制剂药用辅料的检测需求。 采用QDa单四极杆质谱检测器，不仅可以准确地定量还可以给出吐温20的质谱信息(m/z)，通过质谱信息我们可以对制剂中含有的其他辅料进行分离。 使用ACQUITY Arc/QDa系统测定注射液中泊洛沙姆F68的含量 样品前处理方法 1.注射液样品用水稀释10倍； 2.取100 uL 加入500uL乙腈，涡旋混匀；3.4°℃ 12000 r/min 离心15 min； 4.取上清液，进样2pL。 仪器型号LC System ACQUITY Arc； ACQUITY QDa 控制软件 Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column XBridge Cig Direct Connect HP 2.1x30 mm， 20 pm，部件编号：186005232 流速(mL/min)Flow Rate 0.800 柱温(℃)Column Temperature 40 流动相 Mobile phase A：水 B：异丙醇 C： 10 mM甲酸铵溶液 QDa参数 离子源 MS Scan m/z) 毛细管电压(kV) 锥孔电压(V) Probe温度C ESI (+) 500-1100 1.2 15 600 QDa 测定结果 F68标准曲线结果 图2.F68标准曲线线性图。 图1.F68标准溶液：100 ppm； TIC 图(m/z：500-1100)。 SampleName XValue Response calc.Value % Dev3ion Manual ignore 1 F68 10ppm 10 94796469 94 -5.8 NO No 2 F68 50ppm 50 499718915 53.0 6.1 NO No 3 F68 100ppm 100 943908140 100.9 0.9 No No 4 F68 150ppm 150 1397872414 149.9 -0.05 No No 5 F68 200ppm 200 1875056999 201.3 065- No No 6 F68 250ppm 250 2282176696 2452 -18 No No 图3.F68标准曲线结果。 2.5 ug/mL标准溶液同方品方法处理，被稀释6倍，溶液中F68实际浓 图5.F68定量限LOQ。 Peak Summary with Statistics Area Height 20942130 1042679 14.9 图6.F68检出限与定量限信噪比。 重现性结果 10 ug/mL标准溶液连续进样6针峰面积的重现性RSD为1.4% 图7.F68标准溶液10 ug/mL重现性结果。 分别做低中高，三个浓度的加标回收率，回收率结果均在100%- 图8.F68加标回收率谱图。 图9.F68加标回收率结果。 结论 QDa对F68的定量限为0.42 pg/mL， 选择性好，灵敏度高。传统方法使用SEC柱，存在耗时长、色谱柱易污染、寿命短等问题；得益于QDa的选择性和定性能力，即使P68与干扰物吐温80没有完全分离时，通过提取F68m/z： 900-1100段XIC色谱图，并移除吐温80特征信号915、937与959等，可以排除吐温80对F68的干扰，从而实现准确定量。 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统进行聚丙二醇定量分析 样品前处理方法 采用10%异丙醇溶液溶解、稀释样品 仪器型号LC System ACQUITY UPLC H-Class； ACQUITY QDa 控制软件Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column Oasis MAX， 2.1 x20 mm， 30um，部件编号：186002052 流速(mL/min)Flow Rate 0.800 柱温(C) Column Temperature 30 流动相 Mobile phase A：水(2%甲酸) B： 异丙醇(2%甲酸) QDa参数 离子源 MS Scan m/z 毛细管电压(kV) 锥孔电压(V) 采集频率(HZ) ESI(+) 600-1200 0.8 20 2 QDa PEG 色谱图及质谱图 QDa 定量结果 样品稀释不同倍数进行定量，其最终结果变化为91.26%-107.34% 样品稀释倍数定量结果(ppm)换算结果 (ppm) 稀释10倍 2.6 26.2 稀释5倍 6.1 30.8 稀释3倍 9.7 29.1 均值 28.7 QDa 线性结果 QDa 残留考察 4x10- 结论 借助于UPLC技术， Oasis MAX柱成功的保留聚丙二醇样品，QDa检测器成功定性定量样品中的聚丙二醇，方法重现性良好。 ( 运用QDa检测器可以快速检测到聚丙二醇，并在线性范围2 ug/mL-16 ug/mL内R²=0.9945，实现对样品的定量。 ) 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统定量测定蛋白制剂中的组氨酸.精氨酸 样品前处理方法 采用非衍生法，蛋白制剂用水溶解后，用70%乙腈水溶液(含有0.1%甲酸水溶液)稀释，14000 r/min离心5分钟后取上清液进样 仪器型号LC System ACQUITY UPLC H-Class；ACQUITY QDa 控制软件 Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column ACQUITY UPLC BEH Amide， 1.7 pm， 2.1 x100 mm，部件编号：186004801 流速(mL/min)Flow Rate 0.400 柱温(℃)Column Temperature 45 流动相 Mobile phase A： 水(含有0.1%甲酸) B：乙腈(含有0.1%甲酸) QDa参数 离子源 SIR：[M+H]*组氨酸 SIR：[M+H]*精氨酸 毛细管电压(kV) 锥孔电压(V) 采集频率(HZ) ESI(+) 156 1751 0.8 25 2 QDa 测定结果 组氨酸线性范围0.05 pg/mL-5 pg/mL， R=0.9971，结果见下图： 精氨酸线性范围0.05 ug/mL-5 ug/mL， R=0.9953，结果见下图： 3500.004000.004500.005000001AmounE XVEue RES0005 C8C.VUe %Devaion Manual Poirt grone 501 1976266 507 14 r 2101 9350881 1380 -59 r r 3001 485681 2874 41 r r 5101 27331567 5269 53 r 5 10001 5421855 150 45 r 50001 202933323 45393 .12 r IVle HES000S Cac. Vaue %Devaton MenalPort onre 1 500 2243335 510 21 r r 2 2000 1224144 1530 81 3 3000 17451531 2843 52 4 5000 34003139 5350 71 r r 57 10000 6515815 10562 58 5000 36114191 4300 -03 QDa 定量限 0.05 ug/mL QDa 重现性结果 精氨酸样品连续进样6针峰面积的重现性RSD为0.9%，结果见下图： Peak Summary with Statistics Name： Arginine sampleName Name RetentionTime(min) Area 1 S-2 Arginine 5.327 5331900 2 S-2 Arginine 5.327 5309695 3 S-2 Arginine 5.329 5323251 4 S-2 Arginine 5.328 5271783 5 S-2 Arginine 5.325 5378430 S-2 Arginine 5.324 5402181 Mean 5.326 5336206.7 Std. Dev. 0.002 47276.0 % RSD 0.03 0.9 结论 一针进样可以同时检测组氨酸和精氨酸，该方法灵敏度好，组氨酸和精氨酸0.05 ug/mL浓度信噪比分别是71.8、128.9(由于样品中组氨酸和精氨酸含量比较多，所以此应用列出的定量限是为满足样品测定的需要， LOQ 还可以更低)；：线性范围宽(0.05-5ug/mL， R均在0.995以上)； 此方法重现性佳，样品连续进样6样峰面积的RSD小于2%；样品前处理无需衍生化处理，简单快捷。 使用ACQUITY UPLC H-Class/QDa系统定量测定蛋白制剂中的蔗糖、甘露醇 样品前处理方法 蛋白制剂用水溶解后，再非50%乙腈水溶液稀释后上样分析 仪器型号LC System ACQUITY UPLC H-Class；ACQUITY QDa 控制软件 Control Software Empower 3 FR2 色谱柱Column ACQUITY UPLC BEH Amide， 1.7 pm， 2.1 x100 mm，部件编号：186004801 流速(mL/min)Flow Rate 0.700 柱温(℃)Column Temperature 85 流动相 Mobile phase A：乙腈/水/异丙醇=90/5/5(含有500 ppb盐酸胍和0.05%二乙胺) B：乙腈/水=80/20(含有500 ppb盐酸胍和0.05%二乙胺 QDa参数 离子源 SIR：[M+CI]蔗糖唐 SIR：[M+CI]甘露醇 毛细管电压(kV) 锥孔电压(V) 采集频率(HZ) ESI(-) 377 217 0.8 25 QDa 测定结果 蔗糖线性范围0.05 pg/mL-40 ug/mL， R’=0.9935，结果见下图： XValue Response Calc. Value % Deviaton ManualPoint ignore 1 0.05 172232 0.05 4.8 r 厂 2 0.1 403724 0.09 .41 3 02 87105.4 0.1 -82 4 04 1888359 03 .72 s 05 2488302 04 -32 10 5470272 1.0 5.1 7 2.0 11059368 2.1 5.0 8 40 21213297 40 20 50 26382387 50 1.9 10 100 54034469 10.7 7.4 11 20.01 9339280.7 19.4 -26 12 40.0 10672149.3 39.1 -21 甘露醇： LLOQ=0.05 ug/mL， s/n=18.9 蔗糖样品连续进样6针峰面积的重现性RSD为1.4%，结果见下图： Peak Summary with Statistics Name： Sucrose SampleName Vial Inj Name RetentionTime(min) Area 1 CP-1 2：D.1 1 Sucrose 5.049 107393 2 CP-1 2：D.1 1 Sucrose 5.046 1000G0 3 CP-1 2：D，1 1 Sucrose 5.U45 107304 4 CP-1 2：D.1 1 Sucrose 5.04G 106940 5 CP-1 2D.1 1 Sucrose 5.847 105023 CP-1 2：D.1 1 Sucrose 5.848 104916 Mean 5.847 106706.0 Sld. Dev 0.001 1465.7 %RSD 0.02 1.4 甘露醇样品连续进样6针峰面积的重现性RSD为1.4%，结果见下图： SongieNarse C-1 03209303426AM CT.Vaf 20Liinton Peak Summary with Statistics Name： Mannitiol SampleName Vial Name RetentionTime (min) Area 1 CP-1 2：D.1 Mannttiol 1.927 478065 2 CP-1 2.D.1 Manngiol 1.928 478507 3 CP-1 2：D.1 Mannziol 1.926 467140 4 CP-1 2：D.1 Mannziol 1.928 470234 5 CP-1 2：D.1 Mannziol 1.926 479905 6 CP-1 2：D.1 Manntiol 1.925 405702 Mean 1.927 476738.8 Std. Dev. 0.001 6835.7 % RSD 0.06 1.4 沃特世科技(上海)有限公司 地址：上海市浦东新区金海路1000号 金领之都13栋 邮编：201206 电话：021-61562666 传真：021-61562777 北京分公司 地址：北京市朝阳区铜牛国际大厦 光华路15号院2号楼9层 邮编：100026 电话：010-5209 3866 传真：010-52932298 广州分公司 地址：广州市荔湾区中山七路50号 西门口广场1707-08室 邮编：510170 电话：020-28296555 传真：020-2829 6556 成都分公司 地址：成都市高新区科园南路88号 天府生命科技园孵化楼C1栋411室 邮编：610023 电话：028-67653588 扫一扫，关注沃特世微信 传真：028-67653580 沃特斯中国有限公司 地址：香港新界沙田科学园 Www.waters.com 科技大道西16号907-908室电话：852-29641800 传真：852-25496802 全国免费售后服务热线： 800(400)820 2676 Www.waters.com Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters和The Science of What’s Possible是沃特世公司的商标。 C2018沃特世公司中国印刷：2018年9月720006518ZH 沃特世对药用辅料的含量测定（如吐温、聚丙二醇、氨基酸、糖）开发了完整的解决方案，为生物制剂中常用的药用辅料的定性定量提供了理想的分析手段。