单克隆抗体中带电变体检测方案(液相色谱仪)

(a)丢失C端赖氨酸 pH梯度洗脱用于改善单克隆抗体带电变体的分离 应用报告 生物制药 作者 摘要 Andrew CoffeyAgilent Technologies， Inc. 离子交换是温和条件下分离蛋白质混合物的一个非常有用的技术，最常见的是应用增加盐浓度的缓梯度溶液进行洗脱。pH梯度洗脱使用频率较低(除专属应用外，例如色谱聚焦)，并且需要复杂的缓冲液体系。尽管如此，如今的四元液相色谱系统完全能利用常规缓冲盐实现 pH梯度洗脱。本篇应用报告中，我们展示了 pH 梯度洗脱在分离单克隆抗体带电异构体时的优势。本文的工作使用了 Agilent Bio mAb 色谱柱、安捷伦 1260 Infinity生物情性四元液相色谱系统和安捷伦缓冲液顾问软件。 Agilent Technologies 前言 蛋白质是复杂的生物分子，含有无数的带有酸性和碱性侧链官能团的氨基酸。这些官能团的范围从羧酸类(天冬氨酸和谷氨酸)和酚类(酪氨酸)到胺类(赖氨酸和组氨酸)和胍类(精氨酸)，还包括其他中性或疏水性性基。在给定的 pH条件下，蛋白质将带有一定电荷(除了等电点处净电荷为0外)，并且可以与带有相反电荷的吸附剂发生作用。因此，碱性蛋白质将在阳离子交换色谱柱上获得保留。 常规的离子交换方法使用增加离子强度(盐浓度)的方法进行洗脱，从而盐离子与蛋白质和吸附剂进行竞争吸附并最终使蛋白质分子从色谱柱上洗脱下来。然而， pH 梯度也可用于该类洗脱。对于阳离子交换色谱，增加 pH 使得蛋白质变成中性或带上负电荷，从而可以从色谱柱上洗脱下来。 随着更多复杂的蛋白质被用于研究和分析，这种方法开始受到更多的重视，复杂蛋白质如单克隆抗体，生物制备过程细微的变化即可能导致带电变体的产生。这些细微差异包括 C端赖氨酸的丢失、脱酰胺基作用和唾液酸化作用(使分子酸性更强)、或者形成琥珀酰亚胺和羧酸侧链的酰胺化(使分子碱性更强)等，如图1所示。 本文中我们展示了用于分离单克隆抗体带电变体的 pH梯度方法，该分离用传统的缓冲盐梯度洗脱时难以达到分离的效果。 材料和方法 安捷伦 Bio IEX 色谱柱填充的是接枝了官能化亲水聚合物层的刚性无孔聚合物填料。这种刚性填料降低了全多孔填料因扩散效应而产生的峰展宽效应，因而具有高分辨率和高分离效率。化学键合的亲水涂层显著降低了非特异性结合，从而使得回收率更高。 通过具有四通道的安捷伦1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱泵来混合不同比例的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液，可以制备出精确离子强度和 pH 的缓冲液。这一实验室常用的缓冲液体系具有较宽的pH范围(一般为 pH5.7到8.0)。 (b)多糖的唾液酸化作用 (c)酰胺化/脱酰胺化作用 (d)琥珀酰亚胺的形成 0 图1.导致带电变体的反应 为了使这一过程更快速，本文使用了安捷伦的一个标准软件程序：缓冲液顾问软件(如图2a、2b和2C)。通过输入适当的缓冲液条件和储备溶液组成，软件可以自动计算出四元泵所需要的梯度表格。 色谱条件 色谱柱 Agilent Bio MAb， NP5， 4.6×250 mm 流动相 A：水 B： 1.6 M NaCl C： 100 mM NaH，PO， D： 100 mM Na，HPO 通过将C和D按预设比例混合，获得了所需 pH范围的特定 离子强度的缓冲液。 梯度程序 pH 6.0到8.0， 0到20分钟 0到 800 mM NaCl， 20 到25分钟 800 mM NaCl， 25 到 30分钟 流速 1.0 mL/min 温度 室温 进样体积 10 pL 样品 IgG 单克隆抗体 样品浓度 2 mg/mL (溶于 20 mM磷酸钠缓冲液， pH 6.0) 检测器 UV， 220 nm 仪器 安捷伦1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统 图2a.安捷伦标准缓冲液顾问软件的屏幕截图(显示为了维持线性pH梯度程序而增加的过渡梯度：3.22、5.63、13.5、16.5和21.5分钟) 图2b.安捷伦标准缓冲液顾问软件的屏幕截图(未优化、无过渡梯度设置时，显示出非线性梯度) 图2c.安捷伦标准缓冲液顾问软件的屏幕截图(显示制备缓冲液储备溶液的配比) 结果和讨论 我们已经证明在弱阳离子交换色谱柱分离蛋白时pH的重要性，以及使用缓冲盐梯度分离时 pH对保留时间的影响(安捷伦应用报告5990-9628CHCN)。可通过轻微改变 pH 来改变色谱选择性。此外，弱阳离子交换色谱柱的性能也受到离子强度的影响(如图3所示)。因此，离子强度在 pH梯度分离中也起到重要作用这不足为奇。 图4显示了一系列 IgG 单克隆抗体的分离色谱图。每个色谱图均由以下梯度运行： pH6.0到8.0(0到20分钟)，接着是常规缓冲盐梯度净化色谱谱(20到25分钟)以及色谱柱重新平衡(25.01到35分钟)。每个色谱图对应的缓冲液浓度都不同，同时相应的离子强度也不同(从20到50mM)。实验中，使用了缓冲液顾问软件以相同的储备溶液制备出所需的梯度时间表。 在所有实验中， IgG 在 pH梯度的后半部(pH7.0和8.0间)洗脱出峰，并且在离子强度20mM 时， IgG样品直到梯度洗脱运行缓冲盐净化色谱柱时才被洗脱下来，因此，此方法可以进一步改进以优化分离。 图4显示了30mM缓冲液离子强度洗脱条件下获得了更大的分离度。但是，这也可能是因为 IgG 在pH梯度后后半部分流出而造成的。因此，使用缓冲液顾问软件为30 mM 和50mM 缓冲液离子强度下，运行一个更缓的 pH梯度程序进行分离，分别从 pH 7.0到8.0，0到20分钟和从 pH 6.5到7.5，0到20分钟。 12 图3.弱阳离子交换剂的典型滴定曲线 图4.不同离子强度下IgG单克隆抗体的分离色谱图 图5a 和5b 显示了 IgG 主色谱峰在11分钟时洗脱下来的色谱图(其中酸性带电变体流出较早而碱性带电变体流出较晚)。这两个色谱图实际上非常地相似，只是30mM 缓冲液离子强度时带电变体的色谱峰形稍微更好。 进一步的优化和改善分离度，可以尝试通过延长梯度时间，或者进一步降低 pH范围来实现。 分离复杂蛋白质(例如单克隆抗体)时使用的 pH梯度离子交换色谱是色谱分析中的一种有效的手段。然而，，简单地制备两种不同pH 的缓冲液并以线性梯度方式运行并不能获得 pH的线性变化。为了确保获得所需的精确 pH梯度，必须使用计算机软件进行计算。该方法对色谱分析条件和离子强度特别敏感，并且启始和终止 pH也会对选择性有较大的影响。 16分钟 图5b. pH 6.5到7.5(0到20分钟)， 50mM 时IgG单克隆抗体的色谱图 更多详细信息 这些数据代表了典型的结果。有关我们产品和服务的更多信息，请访问 www.agilent.com/chem/cn. www.agilent.com/chem/cn 安捷伦科技公司对本资料中所包含的错误，以及由于使用本资料引起的相关损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和性能指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2011 2011年12月16日， 中国印刷 5990-9629CHCN Agilent Technologies 离子交换是温和条件下分离蛋白质混合物的一个非常有用的技术，最常见的是应用增加盐浓度的缓梯度溶液进行洗脱。pH 梯度洗脱使用频率较低（除专属应用外，例如色谱聚焦），并且需要复杂的缓冲液体系。尽管如此，如今的四元液相色谱系统完全能够利用常规缓冲盐实现pH 梯度洗脱。本篇应用报告中，我们展示了pH 梯度洗脱在分离单克隆抗体带电异构体时的优势。本文的工作使用了Agilent Bio mAb 色谱柱、安捷伦1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统和安捷伦缓冲液顾问软件。