药品中水分活度检测方案(水活度分析仪)

药物分析杂志CChin J Pharm Anal 2018，38(10)·1837· 浅析水分活度测定在非无菌制剂微生物控制中的应用* 绳金房'，李辉l，马仕洪2，杨晓莉'，胡昌勤2** (1.陕西省食品药品监督检验研究院，西安710065；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050 ) 要：以美国药典(USP)收载的1112章节“水分活度测定在非无菌制剂中的应用”为参考，从水分活度的概念，测定原理与方法、与微生物的关系以及在药品质量控制中的应用、意义、问题和不足等角度，介绍和分析水分活度测定在非无菌制剂中的应用。USP 率先将水分活度应用于制药领域微生物控制，代表了非无菌制剂的微生物控制由微生物限度测试逐渐向微生物风险评估下的参数放行转变的发展趋势，其理念更为科学合理，控制方法更为简便灵活。对水分活度的理解和认识有助于推动《中华人民共和国药典》2020年版相关内容的增订与推广。 关键词：水分活度；美国药典；中华人民共和国药典；微生物控制；非无菌制剂；药典增订 中图分类类：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2018)10-1837-05 doi：10.16155/j.0254-1793.2018.10.26 Application of water activity determination of microbialcontrol in nonsterile pharmaceutical products SHENG Jin-fang'， LI Hui'， MA Shi-hong'， YANG Xiao-li'， HU Chang-qin?** (1.Shaanxi Institute for Food and Drug Control， Xi’an 710065， China； 2. National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China ) Abstract： The application of water activity determination of nonsterile pharmaceutical products which is relativeto microbiological control in USP 40 was taken as reference. The application of water activity determination ofnonsterile pharmaceutical products was introduced from the concepts of water activity，the principle and methodof determination，the relationship with microorganisms， the application， significance， problems and shortcomingsand development trends of drug quality control. USP pioneered the microbiological control standards withwater activity applications in the pharmaceutical industry， which represents the developing trend of microbialcontrol of non-sterile agents from a comprehensive microbiological limit test to the evolution of parametersunder microbial risk assessment. The control method became simpler and more flexible. The idea became morescientific and reasonable. Exploring and understanding knowledge of water activity will help to promote therevision and development of relevant content of Pharmacopoeia of the People’s Republic of China 2020 edition.Keywords： water activity； USP； Pharmacopoeia of the People’s Republic of China； microbiological control； nonsterilepharmaceutical products； pharmacopoeia revision ( * 国家药典委员会课题(15)水分活度测定在非无菌制剂微 生 物控制中的应用 ) ( **i 通信作者 Tel： 13910109199；E-mail：hucq@nifdc.org.cn ) ( 第一作者 Tel：13379253836； E - mail： shengkangjia@163.com ) 微生物指标是反映药品安全性和有效性的重要指标，而水在药品生产中用量大，使用广，用于生产过程及药物制剂的制备21，药品中不可避免地含有水分。长期以来，水分含量是反映药品质量安全和稳定的一个重要参数。然而，用于控制微生物导致的变质，水分活度( water activity )是比水分含量更重要的一个参数，它是产品中微生物可利用水的量度3，是影响微生物生长的关键因素之一。过低或过高的 pH，营养缺乏，含某些表面活性剂，添加的抑菌剂以及低水分活度等产品属性，都将有助于防止微生物生长繁殖4。美国药典(USP)<1112>水分活度测定在非无菌制剂中的应用于2006年发布5习，用以指导水分活度在非无菌制剂微生物控制中的应用，包括一系列微生物生长需要的水分活度数据和基于产品水分活度的微生物限度检查建议，推荐水分活度的测量方法等内容6。本文浅析非无菌制剂水分活度测定的应用，探讨应用水分活度以实现药品的微生物控制。 1 水分活度概述 水分活度(a)，是相同温度下产品水蒸气压(P)与纯水蒸气压(P)的比值。它在数值上等于封闭系统中由产品产生的相对湿度(RH)的1/100。RH可通过直接测量蒸汽压或露点的方法获得，也可通过传感器间接测量，传感器的物理或电学特性会随着所处环境的相对湿度的变化而变化。水分活度和平衡相对湿度(ERH)之间的关系由以下等式表示： 水分活度是物理化学术语，反映产品中水的能量状态，表示水与产品成分之间结合的紧密程度，a值介于0~1。 水分活度测定一般采用物理或化学方法，最常用的方法有水分活度仪测定法和恒定相对湿度平衡法(康卫氏皿扩散法)。国际上多采用仪器测定法14.7-9，我国食品安全国家标准一直以来均采用恒定相对湿度平衡法(康卫氏皿扩散法)[10-13，现行版《食品安全国家标准食品水分活度的测定》首次收载仪器测定法作为第二法。《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版收载了费休氏法等5种水分测定方法14J，但尚未收载水分活度的测定方法。目前，水分活度测定常用的3种方法是露点/冷面镜法、电子湿度计法和相对平衡湿度法。 露点/冷面镜法是 USP、欧洲药典(EP)L15、日本药局方(JP)L16J美国分析化学家协会(AOAC)、国际 标准化组织(ISO)等推荐的测定水分活度的标准方法，使用此法进行水分活度测定时，需要对其适应性进行评价、验证和校准。这些仪器通常使用如表1所列的25℃饱和盐溶液校准。 表1用于校准水分活度测定仪器的标准饱和盐溶液 Tab.1SStandard saturated salt solutions used to calibratewater activity determination instruments 饱和盐溶液( saturated salt solution ) ERH/% aw 硫酸钾(K，SO)(potassium sulfate) 97.3 0.973 氯化钡(BaCl， )(barium chloride ) 90.2 0.902 氯化钠(NaCl)(sodium chloride) 75.3 0.753 硝酸镁(Mg(NO，)2)(magnesium nitrate) 52.9 0.529 氯化镁(MgCl，)(magnesium chloride ) 32.8 0.328 电子湿度计法通常采用电子湿度传感器测量水分活度，是通过测量密闭的样品顶部空间达到平衡后的温度和蒸汽压来实现的117-181。测量时应严格控制和测量样品与传感器之间的温度19.。恒定相对湿度平衡法(康卫氏皿扩散法)在密封、恒温的康卫氏皿上，试样中的自由水与水分活度较高和较低的标准饱和溶液相互扩散，达到平衡后，根据试样质量的变化量，求得样品的水分活度。在没有水分活度仪的情况下，这是一个很好的替代方法，不足之处是工作量大，分析烦琐，平衡时间较长。 2水分活度与微生物生长的关系 1953年 William James Scott 发现了水分活度影响微生物生长120-211，1957年提出了微生物生长所需的最低的水分活度限值，并明确了是水分活度而不是水分含量影响微生物生长”。目前这一概念已经作为预测微生物生长，反映产品稳定性和安全性的参数而被广泛认可。降低水分活度将会导致微生物生长停滞期的延长，代谢活性的降低，生长繁殖速率的降低，细菌内生孢子和霉菌孢子活性的降低，产生毒素的减少，以及细菌孢子耐热性增加等作用123-24。 在微生物学中细菌、酵母菌和霉菌的新陈代谢、繁殖、孢子萌发和生存需要可利用水，水分活度是反映存在于产品中微生物新陈代谢的可利用水(非结合水或自由水)的量度25。因此水分活度是预测产品中潜在微生物生长繁殖的有力工具。 水分活度可反映产品中潜在微生物的生长繁 殖状况。一定的水分活度环境仅支持特殊类型的微生物生长。革兰阴性菌生长所需最小水分活度一般在0.91~1.00范围内，而革兰阳性菌、酵母菌和霉菌生长的最低水分活度要求低于革兰阴性菌，可以在更干燥条件下生存。较高水分活度(a>0.85)环境中，细菌会与真菌竞争营养物质，细菌的生长超过真菌。革兰阴性菌中包括某些致病微生物，如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和沙门氏菌在a<0.91 的产品中不会增殖或存活，而革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌将在a<0.86时不会增殖，黑曲霉在a<0.77时不会增殖。此外，包括最耐受高渗的酵母菌和耐旱真菌在内的所有微生物在a，<0.60时不会增殖。表2中所列是在25℃时一系列与制药相关的代表性微生物生长所需的最低水分活度。这些a数据已被科学文献确认和证明，且适用于原料、辅料和成品1251 表2代表性微生物生长所需的最低水分活度(a) Tab.2 Water activities (a)required to support thegrowth of representative microorganisms 细菌 aw 霉菌和酵母菌 aw (bacteria) (molds and yeast) 铜绿假单胞菌 0.97 黑根霉 0.93 ( Pseudomonas aeruginosa ) (Rhyzopus nigricans ) 蜡样芽胞杆菌 0.95 毛霉 0.92 ( Bacillus cereus ) (Mucor plumbeus ) A型肉毒梭菌 0.95 红酵母 0.92 ( Clostridium botulinum， ( Rhodotorula mucilaginosa ) TypeA) 大肠埃希菌 0.95 酿酒酵母 0.90 ( Escherichia coli) (Saccharomyces cerevisiae) 产气荚膜梭菌 0.95 拟青霉 0.84 ( Clostridium perfringens ) ( Paecilomyces variotti) 绿色乳酸杆菌 0.95 产黄青霉素菌 0.83 (Lactobacillus viridescens ) (Penicillium chrysogenum) 沙门菌属 0.95 烟曲霉 0.82 (Salmonella spp.) (Aspergillus fumigatus ) 产气肠杆菌 0.94 青霉菌 0.81 ( Enterobacter aerogenes ) (Penicillium glabrum ) 枯草芽孢杆菌 0.90 黄曲霉 0.78 ( Bacillus subtilis) (Aspergillus flavus ) 微球菌溶酶体 0.93 黑曲霉 0.77 (Micrococcus lysodekticus ) (Aspergillus niger ) 金黄色葡萄球菌 0.86 鲁氏酵母(嗜高渗酵母) 0.62 (Staphylococcus aureus ) [Zygosachharomyces rouxii (osmophilic yeast ) 嗜盐细菌 0.75 耐旱霉菌(xerophilic fung ) 0.61 ( halophilic bacterium ) 3 水分活度在非无菌制剂微生物控制中的应用 通过测量和控制药品处方的水分活度，可以减少或消除微生物增殖风险。在稳定储存条件下水分活度是药品的固有属性。在科学的微生物风险评估的基础上，可根据水分活度制定有针对性的个性化微生物控制方案，如全面的微生物限度检查或减少日常检查。应注意的是使用水分活度进行微生物控制，必须遵循严格的 GMP，以确保微生物的最低负载。这种微生物控制理念为药品微生物控制提供了新的思路和方向。USP<1112>提供了药品处方对微生物污染影响的指导，降低药品水分活度对预防潜在微生物的增殖大有裨益；非无菌制剂的处方、生产步骤和测试应反映这一参数。 非水液体或固体剂型由于其低水分活度而不支持孢子萌发或微生物生长，其微生物监测的频率可以通过审查产品的历史测试数据和证明原材料、水、生产过程、制剂和包装的微生物控制有效性来确定。历史测试数据包括在产品开发、生产、过程验证和足够的产品批次(至少20批)常规测试中的微生物监测数据，以确保产品极小的或无微生物污染的可能。 水分活度远低于0.75(例如：片剂，胶囊，非水液体药品，软膏和栓剂等剂型)的药品将是减少微生物限度检查和稳定性评价极佳的研究对象。在进行药品生产时如原辅料微生物指标优良，生产环境不产生微生物污染，本身具有减少微生物的生产过程，制剂有抗微生物活性，以及生产场所已建立了与其产品相关的低生物负载的历史测试数据时，建立合理的微生物风险评估体系，通过水分活度反映微生物稳定性十分有效。然而，单独的水分活度测量不能作为减少微生物限度检查的理由。表3是基于水分活度的代表药剂和非处方药(OTC)的推荐微生物限度检查策略。原料药的微生物限度检查与此类似。 4 测定水分活度的意义 微生物生长有最低水分活度要求，低于此要求的微生物将不能生长。因此，水分活度控制作为微生物风险控制的关键环节，也是影响药品稳定性的关键参数。通过设计和控制药品水分活度，优化处方，可准确的评估药品的安全性和稳定性，降低微生物增殖风险。不同水分活度的药品中的微生物生存行为对于 表3基于水分活度的代表药剂和非处方药(OTC)的推荐微生物限度检查策略 Tab. 3Microbial limit testing strategy for representative pharmaceutical and OTC drug products based on water activity 产品 水分活度 最大潜在污染物 测试建议 (product) (a) (greatest potential contaminant) (testing recommended) 鼻吸入剂 0.99 革兰阴性菌 TAMC，TCYMC，不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(TAMC， (nasal inhalant) (Gram-negative bacteria ) TCYMC， absence of S. aureus and P. aeruginosa ) 洗发水 革兰阴性菌 TAMC， TCYMC，不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(TAMC， 0.99 (hair shampoo) ( Gram-negative bacteria ) TCYMC， absence of S. aureus and P. aeruginosa ) 抗酸剂 革兰阴性菌 TAMC，TCYMC，不得检出大肠埃希菌和沙门氏菌(TAMC，TCYMC， 0.99 (antacid) ( Gram-negative bacteria ) absence of E. coli and Salmonella spp.) 局部乳膏剂 0.97 革兰阳性菌 TAMC，TCYMC，不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(TAMC， (topical cream ) (Gram-positive bacteria ) TCYMC， absence of S. aureus and P. aeruginosa) 口服液 0.90 革兰氏阳性菌和真菌 TAMC 和 TCYMC (oral liquid) (Gram-positive bacteria and fungi) (TAMC and TCYMC) 口服悬浮液 0.87 真菌 TAMC 和TCYMC (oral suspension) (fungi) (TAMC and TCYMC) 局部软膏 0.55 无 减少测试 (topical ointment) (none) (reduced testing ) 润唇膏 0.36 无 减少测试 (lip balm) (none) (reduced testing) 阴道和直肠栓剂 0.30 无 减少测试 (vaginal and rectal suppositories ) (none) (reduced testing) 片剂 0.36 无 减少测试 (compressed tablets ) ( none) (reduced testing) 液体填充胶囊 0.30 无 减少测试 (liquid-filled capsules) (none) (reduced testing ) 注( note)：TAMC=需氧菌总数； TCYMC=霉菌和酵母菌总数。表中列出的不同剂型的水分活度是代表性的，促使在开发测试策略之前测试它们各自的产品(TAMC =Total aerobic microbial count；TCYMC=Total combined yeast and mold count.The water activities cited in Table3 for the differentdosage forms are representative， and companies are urged to test their individual products before developing a testing strategy) 药品微生物控制非常重要。对于制药工业，非无菌制剂水分活度与以下方面有关：(1)药品处方以及抑菌体系的抑菌有效性；(2)药品处方中易于化学水解的活性药物成分的降解；(3)药品处方(尤其是液体、膏、乳液和霜)易受微生物污染的程度；(4)提供了减少微生物限度检查，依照通则非无菌制剂微生物限度检查法筛查药品有效性、稳定性和控制菌释放的理论依据。低水分活度会防止微生物在药品上的生长繁殖。 符合当前 GMP 生产要求的药品水分活度较低，没有或几乎没有微生物污染的风险，在这种情况下，日常的全面的微生物限度检查没有意义。非水性液体制剂或固体药剂由于其低水分活度，不支持孢子萌发和微生物生长，其微生物监控频率取决于产品的历史测试数据和原料、水、生产过程的微生物污染监测数据261。在科学的微生物风险评估的基础上，采用 水分活度测定进行微生物监控，建立合理的微生物控制策略及设计性能优良的药品对于节约成本，提高效率，提升产品质量具有重要的指导意义。 尽管水分活度有助于微生物污染的风险分析，但不是唯一指标，应考虑其他因素，以确定产品是否需要进一步的微生物限度检查。值得注意的是水分活度是反映微生物生长繁殖的指标，而不是微生物有无的指标，低水分活度与初始微生物负载无关，耐受性更强的微生物包括可产生芽孢的梭菌及杆菌、沙门氏菌和丝状真菌等，尽管在低水分活度时不会繁殖，但仍然可能存在于产品中。因此水分活度是微生物风险评估的有力工具，是对现有非无菌制剂微生物控制体系的有力补充，不能完全代替微生物限度检查，对于水分活度较高，而又不适于降低水分活度的非无菌 制剂，全面的微生物限度检查对保证产品的安全性和有效性仍是十分必要和重要的。 水分活度测定在非无菌制剂中的应用可逐步推进生产企业对药品微生物控制水平的提升，以及解决由大量的无价值检验造成的资源浪费，有助于提高生产效率，降低风险，节省成本。然而，我国制药领域尚未建立水分活度测定的方法，利用水分活度控制微生物生长的应用仍为空白。因此，亟待制定水分活度测定在非无菌制剂中的应用指导原则，《中华人民共和国药典》2020年版计划增订的“水分活度测定在非无菌制剂微生物控制中的应用”相关内容，必将进一步完善我国药品微生物控制体系，以推动我国药品微生物控制的发展迈上新台阶。 ( 参考文献 ) ( 1 杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：微 生 物计数法解读[J].药物分析杂志，2016，36 (6)：1101 YA N G XL，LI H， MA Y Y ， et al. I n terpretation of the mic r obiological e x amination of nonster i le products： micr o bial en u meration te s t o f C h ine s e Pharmacopoeia 2 015 edition[ J ] . Chin J Pharm Anal，2016，36(6)：1101 ) ( [2 ] 杨晓莉，李辉，绳金房.中 、 美、英、欧药典制药用水微生物检查法对比研究[J].西北药学杂志，2013，28(5)：515 YANG X L ，LI H， S HENG JF， et al. Comparative st udy of th emicrobiological test o f pharmaceuti a l wat e r b y using Ch P ， USP，EP and BP methods[ J ] . Northwes t Pharm J， 2013，28 ( 5)：515 ) ( [ 3 ] SCOTT V N， CLA V ERO RS ， TROLLER JA. Measurement of waterac t ivit y (a w )，acidity，and brix [ M ] //F R ANCES P D ， KE I TH I . Compendium o f M e thods f o r The Micr o biological Exami n ation of Foods. 4th E d. W a shi n gton D . C： A merican Pub l ic H ea l th A ssociation，200 1 ：649 ) ( U S P 40-NF 3 5. Vol I [ S ] .2017：106，1445 ) ( U S P 29-NF 2 4 Second Supplement[ S ] . 2006：3802 ) ( [6 ] P ORTER D. Ge n eral inf o rmation 11 1 2 m ic r o b iological at t ributesof n onsteri l e p harmaceutical pr o ducts-application of water activitydetermination[J ] . P h arma c opeia l Foru m ， 2002，28(6)：2009 ) ( [7 ] A OAC978.18 Water Act i vity of Canned Veget a b l e s i n Official M ethods of Anal y s i s[S ]. 1 995 ) ( [8 ] ISO 21807-2004 Mi c robiology of Food and Ani m al Feeding stuf f s-Determinati o n of Wa t er A ctivity [S ]. 2004 ) ( [9 ] ISO 2 9621-2 01 0 Cos m etics Microbiology Guidelines fo r th e Ri s k A ssessment a n d Ident i fication o f M i cro b iological l y Low-ri s k ) ( Products，Switzerland[S ] .2010 ) ( [10 ] 中国商业部. GB 9695.12-1988 肉与肉制品水分活度测定[S ] . 1 988 C hi n a’ s M inistry of Commerce. GB 9695.12-1988 Meat an d Meat Products M ethod of Water A c tivity Determination[S ]. 1 9 88 ) ( [11 ] 国 家进出口商品检验局. SN0180-92中国进出口商品检验行业标准食品水活度测定方法 [ S].1 9 92 China National I mport a nd Ex p ort Commodity Insp e ction Bureau. SN 0 180- 9 2 M e thod of Det e rminatio n of W ater Acti v i t y o f Food[S ]. 19 9 2 ) ( [12 ] G GB/T2349 0 -2009 食品水分活度的测定[S ] .2009 G B/T 2 3 490-2009 Determination of Water A c t i v i ty i n Foods[S ] . 2 0 0 9 ) ( [13 ] G GB 5009.238-2016食品安全国家标准食品水分活度的测定[S] . 2 0 16 GB 5009.238-2016 Na t ional F o od S a fety Standards o f Fo od and Wat e r A ctiv i ty D e terminatio n [S ] .2016 ) ( [14 ] 中华人民共和国药典2015年版.四部[S]. 2 015：103 C hP 2015. Vo l Ⅳ[ S].2015： 1 03 ) ( [15 ] E P 9.0. Vol I [ S ] .2017：369 ) ( [16 ] J J P 17. Vol I [S ] . 2016： 108 ) ( [17 ] RA H MAN MS. Wate r activity and sorption properties of f o od[M ]/ / F ood Properties Handbook， Baca R aton： C R C P r ess， 1995： 1 ) ( [18 ] RAHMAN MS ， SABLANI SS.M e asurement of water act i v i ty b y electronic sens o rs[M ]//RONALD W， TERRY E A， HAEHU N G A，et al. Current P rotocols i n Food A n alytical Ch e mistry. Ne w Yor k ： J ohn Wi l ey & S ons， Inc.，2001： A 2 .5.1 ) ( [19 ] R EID D . F a ctors to consider when esti m ating water vapor pressure [M] / /RONA L D W，TERRY EA ，H AEHUNG A， et al. Curr e nt Protocols in Food A nalytical Chemistry. N ew Y o r k ： John Wi l ey & Sons， Inc . ，2001：A 2 .5.1 ) ( [ 2 0] S C O TT WJ. W ater r e lations of staphyl o coccus aureus at 30 ℃ [ J ] . A us t J Biol Sci， 1953，6 ( 4)： 549 ) ( [21 ] C CHRISTIAN J H B ， SCOTT WJ. W a t e r relations of salmonellae at 30℃ [J ] . A u s tralian J B iol Sci， 1953，6(4)：565 ) ( [22] S SCOTT W J. W a t er re l ations of food spoilage m icroorganisms[ J ] . A dv Food Res， 1957，7：83 ) ( [23 ] MUR R ELL WG，SCOTT WJ. Heat r e sist a nce of bacterial spores at various water activi t ies [ J ]. Natur e ， 1957，179 (4557)：481 ) ( [24 ] FRIESEL R R ， CU N DE L L T. T h e a pplication of wat e r act i v i ty measurement to th e mi c robiological at t ributes t esting of nonsterile ove r -the-counter drug product s [J ] . Pharmacopeial Forum，1998， 24(2)：6087 ) ( [25 ] FRIES E L RR. The application of water a c t i vit y (a )m easureme n tto the microbiological a ttributes testing of raw materials u sed i nthe manufacture of non-sterile p harmac e utica l products[J].Pharmacope i al Forum， 1999 ， 25(6)：8974 ) ( [26 ] C C UN D ELL T. T h e role o f water activ i ty i n the m icrobial stabil it y of n on- s ter i le drug products [J ] . Eur Pharm Rev， 2 015，20(1) ： 5 8 ) ( (本文于2017年11月14日收到) ) www.ywfczz.cn ChinesJournal of Pharmaceutical Analysis 药物分析杂志 药物分析杂志 ChineseJournal of Pharmaceutical Analysiswww.ywfsczz.cn 以美国药典（USP）收载的1112 章节“水分活度测定在非无菌制剂中的应用”为参考，从水分活度的概念，测定原理与方法、与微生物的关系以及在药品质量控制中的应用、意义、问题和不足等角度，介绍和分析水分活度测定在非无菌制剂中的应用。USP 率先将水分活度应用于制药领域微生物控制，代表了非无菌制剂的微生物控制由微生物限度测试逐渐向微生物风险评估下的参数放行转变的发展趋势，其理念更为科学合理，控制方法更为简便灵活。对水分活度的理解和认识有助于推动《中华人民共和国药典》2020 年版相关内容的增订与推广。