单克隆抗体和肽中评估单克隆抗体和肽的生物分离方法并进行方法转换检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 应用纪要 Brooke M. Koshel、Ximo Zhang、Robert Birdsall、Corey Reed、 Stephan Koza、 Zhimin Li和Paula Hong沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 简介 目前市场上的许多畅销药物以及不少正在研发中的药物都是生物制剂。由于生物制剂比小分子药物更复杂，因此其分析方法以及监管机构要求的分析方法往往也比较复杂。迄今为止，生物制剂开发及质量控制实验室使用的分析方法大多都是基于HPLC的方法。尽管HPLC在某些情况下的确可以满足分析需求，但采用更加现代化的仪器改进原来的系统和方法能给实验室带来明显的优势。各监管机构也认可并支持此观点，即通过产品生命周期管理改进制药工艺性能，从而提高产品质量，确保患者安全。 产品生命周期包括产品开发、产品制造以及技术转换。在引入新技术时，仪器是否具有稳定的性能以及是否易于部署非常重要。本文将介绍新上市的生物兼容性UHPLC平台(图1)如何为改进产品生命周期管理提供支持，展示该系统在这方面的优势。将HPLC平台升级，可以获得更出色的分离度和更大的峰容量。由于分析方法需在各个内部实验室以及合同研究机构之间转换，因此必须保证不同实验室都能得到一致的结果。鉴于此，本研究在多个仪器平台之间进行了方法转换，并根据保留时间和峰面积百分比评估了仪器平台的方法转换性能。升级实验室仪器之后，分析人员不仅能完美重现传统方法，还能充分利用新的色谱柱技术和低扩散系统，从多方面提升方法性能。 图1. ACQUITY Arc Bio系统。 ACQUITY Arc Bio系统是一款采用生物惰性材料的四元UHPLC系统，不仅能避免因接触高盐浓度流动相而发生系统腐蚀(不锈钢材料的常见问题)，还能减少残留，是分析生物分子的理想之选。 结果与讨论 完美重现已有方法，确保方法等效性 条件。样品：1mg/mL英夫利昔单抗溶于20mM磷酸钠溶液中，pH 6.8； 色谱柱： Protein-Pak Hi Res SP， 7 pm， 4.6×100mm；流动相(pH6.4)： MPA： 100mM磷酸二氢钠； MPB： 100mM磷酸氢二钠； MPC：500mM氯化钠； MPD：水；流速： 0.5mL/min；柱温：30℃；样品温度：4℃；吸收波长：280nm；进样体积：20pL。 梯度表： %A %B %C %D 初始 14.3 5.7 5.0 75.0 60.00 14.3 5.7 15.0 65.0 65.00 14.3 5.7 70.0 10.0 70.00 14.3 5.7 70.0 10.0 70.10 14.3 5.7 5.0 75.0 图2.英夫利昔单抗的IEX方法转换。在Agilent 1260 Infinity l生物惰性四元系统上运行分析英夫利昔单抗的IEX方法(上图)，然后将该方法转换至ACQUITYArc Bio系统(下图)。由于IgG、IgGK和IgGKK均含有酸性和碱性残基，因此分离出了一组酸性变异体和一组碱性变异体，如上图中的标记所示。通过观察可知两幅色谱图高度相似。对于所有鉴定出的峰，两套系统得到的相对保留时间之间的差异在0.0009~0.0478范围内。 酸性变异体 碱性变异体 IgG IgGK IgG KK 平均值 %RSD 平均值 0 %RSD 平均值 %RSD 平均值 %RSD 平均值 % RSD Agilent 1260 Infinity I 4.45 0.18 3.96 0.74 0.08 10.85 38.83 0.22 0.57 21.49 0.04 0.18 33.9 0.39 1.15 ACQUITY Arc Bio 4.67 0.03 0.61 0.67 0.02 3.17 38.88 0.06 0.15 21.4 0.01 0.06 33.7 0.06 0.16 -0.22 0.07 -0.05 0.09 0.20 表1.IEX峰面积百分比对比。对比Agilent 1260 Infinity l生物系性四元系统和ACQUITY Arc Bio系统三次重复进样的峰面积百分比。无论是在系统内比较还是在两套系统之间比较，所有值都在可接受容差范围内。 通过升级仪器提升分析性能 将传统HPLC方法和仪器升级为更先进的仪器，可提高分离度和峰容量等性能。在下面的示例中，我们分别在HPLC、ACQUITYArc Bio系统和H-Class Bio系统上运行相同的RPLC方法。由于三套系统都使用相同的色谱柱，因此峰展宽的差异在很大程度上要归因于各系统组件之间的差异。面对复杂样品时，仪器峰展宽方面的性能具有重要意义，这将有助于关键分析物对之间实现更好的分离，还有助于提高仪器对杂质的灵敏度。 HPLC Arc Bio H-Class Bio 分离度(峰5和峰6) 1.7 2.7 3.1 峰容量，4o(平均值) 118 170 196 表2.不同LC平台的分离度和峰容量比较。采用相同的方法条件和相同的色谱柱在ACQUITYArc系统和H-Class Bio系统(性能最好)上运行HPLC方法。将传统HPLC系统升级为更加现代化的仪器(例如Arc Bio系统和H-Class Bio系统)可提升分析性能，最终帮用用户更深入地了解产品质量。 样品： MassPREP肽标准品；色谱柱： XBridge BEH C18， 130 A， 2.5 um， 4.6 mm ×100mm；流动相：MPA： 0.1%(v/v)TFA水溶液， MPB： 0.1%(v/v) TFA乙腈溶液；流速：0.5mL/min；柱温：60℃；样品温度：10℃；吸收波长：215nm；进样体积：10pL；梯度：流动相B在10 min内从5%增加到50%。 图3.使用已有方法评估三套系统的性能。分别在HPLC、Arc Bio系统和H-Class Bio系统上采用相同的色谱柱和方法条件运行同一RPLC方法。ACQUITYArc Bio系统和H-Class Bio系统(性能最好)得到的峰宽更窄且分离度更高。(混标组分按洗脱顺序排列如下：1.血管紧张素(片段1-7)、2.缓激肽、3.血管紧张素1、4.血管紧张素ll、5.肾素底物、6.一、7.烯醇酶T35，烯醇酶T37)。 ACQUITY Arc Bio系统兼容用于方法开发和QC分析的色谱柱填料 Fc/2(%) LC(%) Fd'(%) Alliance 34.52 24.43 41.05 Arc Bio 34.23 24.47 41.30 H-Class Bio 34.50 24.31 41.19 表3：三套系统的峰面积(%)。 图4.抗体亚基标准品(经过还原的IdeS酶解NIST抗体)的RPLC色谱图。Waters BioResolve RP色谱柱专为分析完整mAb及其亚基而设计，其填充有2.7pm表面多孔颗粒，适用于所有LC平台。首先在H-Class Bio系统(UPLC)上运行亚基分析，所用色谱柱规格为2.1mmx50mm。然后将该方法放大至4.6 mmx50mm色谱柱，并在Alliance (HPLC)和Arc Bio系统(UHPLC)上运行。所有系统的峰面积分析结果非常一致(见表3)。 条件。如果放大后的条件与H-Class Bio方法的条件不同，则在括号中显示Alliance和Arc Bio的条件。样品：沃特世抗体亚基标准品；色谱柱：BioResolve RP色谱柱， 2.7 um， 2.1 mm ×50 mm (4.6mm×50mm)；流动相： MPA： 0.1%(v/v)TFA水溶液， MPB： 0.1%(v/v) TFA乙腈溶液；流速：0.20 mL/min (0.96mL/min)；柱温：60℃；样品温度：10℃；吸收波长：280nm；进样体积：4pL(19.2pL)；梯度：流动相B在20min内从15%增加到55%。 图5.蛋白混标的HIC分离结果。六次重复进样的保留时间标准偏差<0.007。这证明Arc Bio系统在苛刻条件下进行多次进样也可得到一致的结果。(混标组分按洗脱顺序排列如下：细胞色素C、肌红蛋白、核糖核酸酶A、溶菌酶、烯醇酶、α-糜糜白酶原A)。 条件。样品：HIC蛋白混标；色谱柱： Protein-Pak Hi Res HIC，2.5 pm， 4.6 mmx100mm色谱柱，流动相： MPA： 2M(NH)，SO溶于50mM NaH，PO/Na，HPO溶液中， pH7； MPB： 50mMNaH，PO，/Na，HPO， pH7；流速：0.60 mL/min；柱温：30℃；样品温度：4℃；吸收波长：220nm；进样体积：2pL；梯度：流动相B在15min内从0%增加到100%。 图6.曲妥珠单抗的SEC分离结果。对于每个鉴定出的峰，其保留时间标准偏差<0.004。 条件。样品：2mg/mL曲妥珠单抗；色谱柱： XBridge Protein BEHSEC蛋白分析专用柱，200 A，3.5 u m， 7.8 mm x300mm，流动相：400mM NaH，PO+25 mM NaCl， pH 6.8；流速：1mL/min；柱温：室温；样品温度：4℃；吸收波长：280nm；进样体积：10pL。 图7.曲妥珠单抗的肽图。我们在光学检测后面增加了ACQUITY QDa质谱检测器，以获取补充质谱数据。 图8.(右图)CDR肽(曲妥珠单抗特有的肽)的XIC结果。之前的表征分析采用高分辨率MS进行。 条件。样品：曲妥珠单抗酶解物；色谱柱： XSelect CSH C18， 130 A， 2.5 pm， 4.6mm ×100 mm；流动相：MPA： 0.1%(v/v)FA水溶液， MPB： 0.1%(v/v) FA乙腈溶液；流速：0.5mL/min；柱温：60℃；样品温度：10℃；吸收波长：215nm；进样体积：25uL；梯度：流动相B在60 min内从1%增加到50%； QDa电离模式： ES+，质心；质量范围：350~1250m/z； 毛细管电压：1.5kV；探头温度：500℃；锥孔电压：10V。 肽 平均质量(Da) 电荷态 计算值 (m/z) L3 1991.17 +3 664.7 L5 1773.04 +3 592.0 L7 4190.48 +4 1048.2 H3 1089.21 +3 364.1 H6 1084.18 +2 543.0 H12 2785.01 +3 929.2 ( 表4.曲妥珠单抗的CDR肽。表格中还显示了CDR肽的平均 质量， 以 及ACQUITY QDa质谱检测器检出的各种肽的电荷态。 ) 无需更改方法，即可无缝转换来自不同LC平台的IEX方法 通过升级HPLC仪器可提高分离度和峰容量 在高盐浓度的流动相条件下展示出卓越的重现性 使用一种粒径的填料即可跨LC平台分析mAb亚基 相较于只采用光学检测的分析方法，质谱检测器可作为一种补充 正交检测技术添加至本系统，提高分析结果的可信度 ( 参考文献 ) ( 1. ICH，ICH Q10 Pharmaceutical Quality System. 2008. ) 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 如需下载此海报副本，请访问WWW.WATERS.COM/POSTERS ( 香港：852-29641800 ) ◎2018年沃特世公司。 免费售后服务热线：800(400)8202676www.waters.com 使用创新生物兼容性UHPLC系统评估单克隆抗体和肽的生物分离方法并进行方法转换 使用创新生物兼容性UHPLC系统评估单克隆抗体和肽的生物分离方法并进行方法转换 本文将介绍新上市的生物兼容性UHPLC平台如何为改进产品生命周期管理提供支持，展示该系统在这方面的优势。