十四种磺胺中分离纯化检测方案(超临界色谱)

Agilent 1260 Infinity SFC 串联 Agilent6490000质系系统检测磺胺 应用 食品兽药 作者 摘要 孟颖李建中安蓉 本实验采用 Agilent 1260 Infinity SFC 超临界色谱和配置 iFunnel 技术的 Agilent6490000质谱系统，Zorbax Rx-sil 亚二微米填料色谱柱快速分析了十四种磺胺，其中两组磺胺异构体得到了完全分离，可用于食品中磺胺的快速定性定量分析。用超临界色谱与串联四极杆质谱(SFC-MSMS) 对十四种磺胺进行分离检测，方法简便，分离度高，分析速度及色谱柱平衡更快速，可显著降低流动相成本，同时产生极少的废弃物，避免高昂的废弃物处置费用。 前言 在兽医临床治疗和疾病预防中，抗生素类药物起着不可替代的作用。磺胺类药物作为历史最悠久的抗生素类药物，被广泛用于预防和治疗食源性动物疾病，目前已经有数十个不同品种，然而过量使用这些抗生素会导致食用动物产品中有残留，影响人类的健康。欧盟已经规定动物源性食品中磺胺的最大残留量为100 pg/ kg。目前测定食品中磺胺类药物残留的分析方法有高效液相色谱法，液相色谱质谱，气相色谱质谱，毛细管电泳法，荧光胺衍生化薄层色谱法等。其中 LC-MS/MS 法是检测动物源性食品中兽药残留的一种重要方法，这种方法灵敏度高，选择性和特异性好，能够对低浓度的样品进行很好的定性确认，因此是现在较普遍的测定磺胺残留的方法。但LC-MS/MS 法做到异构体完全分离时分析时间较长，通常需要十五至二十分钟，使用更多的有机溶剂，且在样品前处理后需要挥干有机相溶剂复溶，以减小溶剂效应影响。 采用 SFC-MS/MS 法，使用 Zorbax Rx-sil 亚二微米填料色谱柱，可以在短时间内对十四种磺胺进行分离，其中分子量同为310的磺胺二甲氧嘧啶和磺胺多辛，以及分子量同为280的磺胺甲氧哒嗪，磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶都能够达到完全分离，从而满足定量需求。此外， SFC 与 LC是完全正交的方法，对于磺胡的选择性完全不同。 与液态流动相相比，超临界流体先天具有一个巨大的优势，黏性极低，同时扩散性增大，因此具有更好的传质性能。如今，UHPLC 由于其更高的分离速度，以及在可接受的时间内能够提供以往难以实现的分离度而得到广泛接受。相比而言，超临界流动相的低黏度允许应用小粒径的色谱柱或超长色谱柱，而不会产生过高的背压。Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统可以使用更长的和/或小粒径填料色谱柱在不超过 600 bar 系统压力下工作，结合了UHPLC 和 SFC 的各自优势，从而可获得更高的性能。 磺胺结构图 C8H10N203S Sulphacetamide 磺乙酰胺 CAS 号144-80-9分子量214.24 C10H10N402S Sulfadiazine 磺胺嘧啶 CAS 号68-35-9分子量250.28 CgHgN302S2 Sulfathiazole 磺胺噻唑 CAS 号72-14-0分子量255.32 C11H11N302S Sulfapyridine 磺胺吡啶 CAS 号144-83-2分子量249.29 CH3 NH2 N ^N NH C11H12N402S Sulfamerazine 磺胺甲嘧啶 CAS 号127-79-9分子量264.30 C12H14N402S Sulfadimidine 磺胺二甲嘧啶 CAS 号57-68-1分子量278.33 C11H12N403S Sulfamethoxypyridazine 磺胺甲氧哒嗪 CAS 号 80-35-3分子量280.30 C11H12N403S Sulfameter 磺胺对甲氧嘧啶 CAS 号 651-06-9分子量280.30 OCH3 C11H12N403S Sulfamonomethoxine 磺胺间甲氧嘧啶 CAS 号1220-83-3分子量 280.30 C10H11N303S Sulfamethoxazole 磺胺甲恶唑 CAS 号 723-46-6分子量253.28 H3C CH3HH2NC11H13N303S Sulfisoxazole 磺胺异恶唑 CAS 号 127-69-5分子量267.30 C12H14N404S Sulfadimethoxine 磺胺二甲氧嘧啶 CAS 号122-11-2分子量310.33 C12H14N404S Sulfadoxine 磺胺多辛 CAS 号 2447-57-6分子量310.33 实验部分 实验条件 色谱柱 ZORBAX Rx-sil 3.0×100 mm 1.8pm 仪器 流动相 A： CO2 B：甲醇： 水=98：2 Agilent Infinity 1260 Analytical SFC 系统， 其中包括 SFC 控制模块，二元泵，自动进样器、二极管阵列检测器、真空在线脱气机和安装有六柱切换阀的柱温箱。 梯度 0-5 min B 5%-20% 流速 2ml/min BPR 160 bar 柱温 45°C Agilent 6490000质谱系统， MassHunter B 6.0采集软件和数据处理软件。 进样量 0.3pl 补偿泵 0.2ml/min 补偿泵流动相 20mM甲酸铵甲醇 来源 备注 DikmaPure HPLC 级 CO2 北京市北温气体制造厂 99.999% 乙腈 DikmaPure HPLC级 试样标准品 磺胺 质谱条件： 极性： 正极 (JetStreamESI) 干燥气温度： 200°C 干燥气流量： 16 L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 3500 V 鞘气温度： 350°C 标样制备取十四种磺胺标准品适量，用甲醇配制成标准品溶液。 鞘气流量： 11 L/min 扫描模式： DMRM Compound Name Precursor lon MS1 Res Product lon MS2 Res Fragmentor Collision Energy Sulphacetamide 215 Unit 156 Unit 380 5 Sulphacetamide 215 Unit 92 Unit 380 20 Sulfadiazine 251.1 Unit 156 Unit 380 10 Sulfadiazine 251.1 Unit 108 Unit 380 22 Sulfathiazole 256 Unit 156 Unit 380 10 Sulfathiazole 256 Unit 108 Unit 380 21 Sulfapyridine 250.1 Unit 184 Unit 380 15 Sulfapyridine 250.1 Unit 156 Unit 380 10 Sulfamerazine 265.1 Unit 172 Unit 380 15 Sulfamerazine 265.1 Unit 92 Unit 380 30 Sulfadimidine 279.1 Unit 186 Unit 380 15 Sulfadimidine 279.1 Unit 156 Unit 380 16 Sulfamethoxypyridazine 281.1 Unit 156 Unit 380 15 Sulfamethoxypyridazine 281.1 Unit 108 Unit 380 25 Sulfameter 281.1 Unit 156 Unit 380 15 Sulfameter 281.1 Unit 108 Unit 380 25 Sulfamonomethoxine 281.1 Unit 156 Unit 380 15 Sulfamonomethoxine 281.1 Unit 108 Unit 380 26 Sulfachloropyridazine 285 Unit 156 Unit 380 10 Sulfachloropyridazine 285 Unit 108 Unit 380 25 Sulfamethoxazole 254.1 Unit 156 Unit 380 10 Sulfamethoxazole 254.1 Unit 92 Unit 380 26 Sulfisoxazole 268.1 Unit 156 Unit 380 10 Sulfisoxazole 268.1 Unit 113 Unit 380 10 Sulfadimethoxine 311.1 Unit 156 Unit 380 20 Sulfadimethoxine 311.1 Unit 108 Unit 380 26 Sulfadoxine 311.1 Unit 156 Unit 380 15 Sulfadoxine 311.1 Unit 92 Unit 380 30 结果与讨论 SFC-MS/MS 方法可在5分钟内完成十四种磺胺分离，， 下图为十四种磺胺的 TIC图谱。 MS/MS分离定量时，对于分子量不同的化合物来说，即使不能完全分离也可通过提取不同的离子通道而过到定量要求，但对于分子量完全相同的异构体则必须在质谱入口端达到完全分离方可进 行准确定量。因此对于分子量同为310的磺胺二甲氧嘧啶和磺胺多辛，以及分子量同为280的磺胺甲氧哒嗪，磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶，必须在进入质谱前达到完全分离。采用 Agilent 1260Infinity SFC 超临界色谱和亚二微米的 Zorbax Rx-sil 色谱柱可以达到上述异构体的完全分离。虽然 LC-MS/MS 方法也可将异构体完全分离，但往往需要三倍以上的时间才可能做到。 图1.十四种磺胺的 SFC-MS/MS TIC 图谱 图2.分子离子为311和281的异构体图谱 除上述五个磺胺异构体外，其余九个磺胺异体也可做到准确定量，如下图所示 图3.除异构体外的其余九种磺胺定量离子色谱图 结论 采用超临界色谱法，使用 Agilent 1260 Infinity Analytical SFC 系统，Agilent 6490 QQQ质谱和 Zorbax Rx-sil3.0×100 mm， 1.8 pm色谱柱对十四种磺胺进行检测，方法相比常规LC-MS/MS 法更快速，5分钟内可完成分离，且其中几种分子量相同的异构体均能分离。SFC 与常规 LC是完全正交的方法，选择性差异大，因此可用于 LC互补，解决 LC方法中的一些分离难题。SFC 作为质谱入口技术，与强有机相溶剂完全兼容，样品前处理之后可直接上样。且梯度方法平衡快速，提高了质谱通量。 ( 更多信息 ) ( 本文仅代表典型的结果。更多有关我们产品和服务，请访问我们 的网站： www.agilent.com/chem/cn。 ) www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年1月8日， 中国印刷 5991-3843CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要本实验采用Agilent 1260 Infinity SFC 超临界色谱和配置iFunnel 技术的Agilent6490QQQ 质谱系统，Zorbax Rx-sil 亚二微米填料色谱柱快速分析了十四种磺胺，其中两组磺胺异构体得到了完全分离，可用于食品中磺胺的快速定性定量分析。用超临界色谱与串联四极杆质谱(SFC-MSMS) 对十四种磺胺进行分离检测，方法简便，分离度高，分析速度及色谱柱平衡更快速，可显著降低流动相成本，同时产生极少的废弃物，避免高昂的废弃物处置费用。前言在兽医临床治疗和疾病预防中，抗生素类药物起着不可替代的作用。磺胺类药物作为历史最悠久的抗生素类药物，被广泛用于预防和治疗食源性动物疾病，目前已经有数十个不同品种，然而过量使用这些抗生素会导致食用动物产品中有残留，影响人类的健康。欧盟已经规定动物源性食品中磺胺的最大残留量为100 μg/ kg。目前测定食品中磺胺类药物残留的分析方法有高效液相色谱法，液相色谱质谱，气相色谱质谱，毛细管电泳法，荧光胺衍生化薄层色谱法等。其中LC-MS/MS 法是检测动物源性食品中兽药残留的一种重要方法，这种方法灵敏度高,选择性和特异性好，能够对低浓度的样品进行很好的定性确认，因此是现在较普遍的测定磺胺残留的方法。但LC-MS/MS 法做到异构体完全分离时分析时间较长，通常需要十五至二十分钟，使用更多的有机溶剂，且在样品前处理后需要挥干有机相溶剂复溶，以减小溶剂效应影响。采用SFC-MS/MS 法，使用Zorbax Rx-sil 亚二微米填料色谱柱，可以在短时间内对十四种磺胺进行分离，其中分子量同为310 的磺胺二甲氧嘧啶和磺胺多辛，以及分子量同为280 的磺胺甲氧哒嗪，磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶都能够达到完全分离，从而满足定量需求。此外，SFC 与LC 是完全正交的方法，对于磺胺的选择性完全不同。与液态流动相相比，超临界流体先天具有一个巨大的优势，黏性极低，同时扩散性增大，因此具有更好的传质性能。如今，UHPLC 由于其更高的分离速度，以及在可接受的时间内能够提供以往难以实现的分离度而得到广泛接受。相比而言，超临界流动相的低黏度允许应用小粒径的色谱柱或超长色谱柱，而不会产生过高的背压。Agilent 1260 Infinity 分析型SFC 系统可以使用更长的和/或小粒径填料色谱柱在不超过600 bar 系统压力下工作，结合了UHPLC 和SFC 的各自优势，从而可获得更高的性能。结论采用超临界色谱法，使用Agilent 1260 Infinity Analytical SFC 系统，Agilent 6490 QQQ 质谱和 Zorbax Rx-sil3.0 × 100 mm，1.8 μm 色谱柱对十四种磺胺进行检测，方法相比常规LC-MS/MS 法更快速，5 分钟内可完成分离，且其中几种分子量相同的异构体均能分离。SFC 与常规LC 是完全正交的方法，选择性差异大，因此可用于LC 互补，解决LC 方法中的一些分离难题。SFC 作为质谱入口技术，与强有机相溶剂完全兼容，样品前处理之后可直接上样。且梯度方法平衡快速，提高了质谱通量。