稀释的面包、牛奶、葡萄酒和米粉提取基质中多类有毒生物碱检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent食品检测与农业Trusted Answers 应用 UHPLC/MS/MS 高通量检测食品中多类有毒生物碱 Guoyin Lai， Lijian Wu， Meiling Lu ( 安捷伦科技(中国)有限公司 ) 本应用简报介绍了一种简便的样品前处理方法，结合 Agilent 1290 Infinity II LC 和Agilent 6470A 三重四极杆液质联用系统对食品基质中的多类生勿碱进行高通量测定。采用基质匹配校准标样进行校正，发现在稀释的面包、牛奶、葡萄酒和米粉提取基质中，18种生物碱在0.50-50.0 pg/L 浓度范围内具有非常好的线性。考虑到10倍的稀释倍数，这相当于基质中5.0-500 pg/kg。所有分析物的线性回归系数均大于0.995。在0.5 pg/L 的最低校准浓度下(相当于样品中 5.0 pg/kg)，所有分析物的信噪比(S/N)均大于10。在浓度为5、50和250 pg/kg 的四种不同基质中，分析物回收率范围为90%-110%，相应的相对标准偏差在2.3%-7.9%之间。结果表明，该方法具有很高的灵敏度、准确度和精密度。这种简单的样品前处理与快速LC/MS/MS 检测相结合的方法可以用于食品基质中多类生物碱残留的高通量筛查。 前言 生物碱是一类具有含氮杂环结构的天然碱性物质。它们通常表现出很高的生物活性，是中药的主要成分。生物碱存在于一些植物中，意外摄入可能会造成有害影响。根据欧盟法规2016/239 (EU)，某些婴幼儿谷类食品中的莨菪烷生物碱(包括阿托品和东莨菪碱)的最大残留限量(MRL)低至1 pg/kg。在欧盟No. 37/2010 (EU) 法规中，把秋水仙碱列入了禁止清单3。中国允许在所有动物源性食品基质中使用阿托品，并且未规定MRL， 国内也没有其它法规对食品基质中生物碱的含量进行限制。然而，含生物碱的杂草意外混入农作物或家畜意外摄入含生物碱的杂草可能增加公众的暴露风险。因此，建立灵敏可靠的方法对食品基质中的生物碱进行常规监测至关重要。事实上，生物碱的物理化学性质差异很大，并且还涉及许多复杂的基质。开发一种可靠的方法来同时监测多种生物碱面临着较大的挑战。现有的报道主要集中在具有相似化学性质的生物碱的同时检测15.6。本应用简报提供了一种简单的样品前处理方法，结合快速 LC/MS/MS 方法，实现对牛奶、葡萄酒、面包和米粉等4种食品基质中的5类共18种生物碱的同时高通量测定。 标样制备和样品前处理步骤 所有5类共18种生物碱化合物均购自安谱科技公司(中国上海)，用甲醇配制为1.0 g/L 的储备液，于-20℃下保存。然后用相应的基质提取物稀释储备液，得到校准标样溶液。 液相色谱系统 将固体样品(2.0g)加入 50 mL离心管中，然后加入5mL水进行水化。再加入10mL乙腈，接着加入 5 mLNaEDTA-Mcllvaine 缓冲液 (pH 3)。将离心管充分涡旋混合2分钟，然后在7500 rpm 的转速 液相色谱条件 参数 值 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (3.0×50 mm， 1.8pm) 流动相 A： 0.1%甲酸水溶液；B：甲醇 流速 0.50 mL/min 柱温 40°C 进样量 2.0 pL 梯度 时寸 (min) %A %B 0 1 20 90 10807 20 809 90 10 10 90 10 质谱条件 参数 值 MS Agilent 6470A 三重四夜杆液关联用系统 离子源 安捷伦喷射流 ESI 电离模式 正离子 毛细管电压 3500V 喷嘴电压 500 V 雾化气压力 N2 (35 psi) 干燥气(N)温度 300°C 干燥气流速 8 L/min 鞘气(N)温度 400°C 鞘气流速 12L/min 采集模式 MRM 下离心5分钟。收集上清液，经0.22 um膜过滤后，用 LC/MS进行分析。液体样品(如牛奶和葡萄酒)遵循相同的萃取程序，只是省去初始水化步骤。 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱仪，配备如下模块： ( Agilent 1290 Infinit y ll 二元泵 ， 内置脱气机 ) ( Agilent 1290 Infinity ⅡI 自动进样器， 带针座反冲功能 ) ( Agilent 1290 Infinity lI高容量柱温箱 ) 生物碱在酸性条件下很容易被质子化。因此，实验选择 ESI 正离子电离下的MRM 扫描模式。实验中考察了不同的流动相组合，包括水/甲醇、水/乙腈、0.1%甲酸/甲醇和0.1%甲酸/乙腈。大多数生物碱在甲醇中比在乙腈中的响应更好。在酸化水中，色谱峰更窄、更对称且强度更高；而在非酸化水中，观察到峰拖尾且强度较低。因此，最终选择酸化的水/甲醇作为二元流动相。然后，在所选流动相条件下对 MRM 参数进行了优化。表1列出了得到的参数。对于那些色谱上未能得到理想分离的化合物，通过其特征 MRM 离子对可实现对化合物的准确定量。图1显示了来自不同类别的18种生物碱的典型MRM 叠加色 谱图。 表1.用于高灵敏度检测的优化 MRM 参数 分析物 保留时间 (min) 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量(V) 毒扁豆碱 2.250 275.8 219.2，162.2* 110 7，22* 东莨菪碱 1.898 303.8 137.9，156.1* 120 23，15* 秋水仙碱 4.771 399.9 358.1，309.9* 135 22，32* 士的宁 2.368 334.9 156.1，184.1* 135 55，44* 可的松 5.307 360.9 162.9，121.2* 135 25，36* 伪麻黄碱 1.719 166 148.1，133.0* 80 10，20* 喜树碱 5.262 348.8 305.0，249.0* 135 25，33* 安妥 3.912 202.8 185.8，144.1* 135 20，20* 阿托品 2.554 290 124.1，93.0* 135 26，35* 新乌头碱 4.906 632.1 571.8，105.0* 135 35，60* 次乌头碱 5.059 616.2 556.6，105.3* 135 50，50* 10，11-二甲氧基番木鳖碱 2.594 394.9 243.6，323.9* 135 46，46* 荷叶碱 4.122 295.8 265.1，249.9* 135 15，17* 鬼臼毒素 5.532 414.8 246.6，397.1* 135 10，5* 10-羟基喜树碱 4.773 364.8 320.5，235.7* 135 30，33* 乌头碱 5.119 646.2 586.6，105.3* 135 45，50* 钩吻碱 2.171 322.8 70.1，235.8* 135 32，37* 茄碱 4.965 868.5 98.3，398.1* 135 92，92* *定量离子 图1.不同类别的18种生物碱在浓度为50 pg/L时的叠加 MRM 色谱图 由于生物碱在酸性条件下易溶于水，并以阳离子形式存在。为达到酸性 pH 值，在萃取溶剂中加入 Na，EDTA-Mcllvaine 缓冲液。如图3所示，大多数化合物在 pH值为3和4时的绝对回收率要高于 pH值为5时的回收率。因此，萃取时选择 pH 3的缓冲液。 样品前处理优化和方法性能实验考察了以甲醇和乙腈作为萃取溶剂时的效果。结果表明，乙腈可提供更高的回收率。此外，还考察了所需的萃取溶剂体积。如图2所示，随着萃取体积从5mL增加到10mL，各种生物碱的回收率均有所提高，大部分化合物的绝对回收率大于60%。当体积从10mL增加到15mL时，两种化合物的回收率下降，而其它化合物的回收率继续增加。考虑到萃取会导致实际样品被稀释而影响灵敏度，因而选择10mL 萃取溶剂进行目标化合物的萃取。 利用在基质和纯溶剂中得到的线性响应斜率的比值来评估基质效应。结果发现，基质，尤其是面包，对可的松和鬼臼毒素的影响较为严重(图4)。 因而，为降低基质效应带来的定量偏差，采用基质匹配校准曲线进行定量分析。结果表明，生物碱类化合物在0.5-50 pg/L范围内表现出出色的线性，线性回归相关系数(R)均高于0.995。在0.5 pg/L(考虑到方法的10倍稀释，相当于样品中5.0 pg/kg)的最低校准浓度下，18种生物碱的信噪比均大于10。因此，18种生物碱的定量限 (LOQ) 统一为 5.0 ug/kg。 在3种添加浓度(5、50和250 pg/kg)下对4种基质的样品进行加标实验，每种基质一式六份，分析加标样品，评估分析方法的回收率和精密度。相应的进样溶液浓度分别为0.5、5.0和25 ug/L。从表2可以看出，所有基质在各浓度下的回收率均在82%-119%之间， %RSD在2.3%-7.9%之间，表明该方法的准确度和精密度均满足定量分析的要求。 表2.不同食品基质中3个加标水平下生物碱的平均回收率和相对标准偏差(n=6)一览表 分析物 加标浓度(ug/kg) 葡萄酒 牛奶 米粉 面包 回收率(%) RSD (%) 回收率(%) RSD (%) 回收率(%) RSD (%) 回收率(%) RSD (%) 10，11-二甲氧基番木鳖碱 0.5 86 3.7 105 3.6 109 7 106 2.9 5 105 5.1 101 4.2 103 5.2 116 3.5 50 103 4.7 108 5.5 119 3.7 108 3.3 荷叶碱 0.5 91 2.4 117 3.6 112 2.9 97 4.7 5 117 6.3 115 5.3 98 2.5 114 4.3 50 96 5.6 104 4.4 117 3.5 109 3.2 鬼臼毒素 0.5 83 6.5 108 6.5 110 7.9 85 2.4 5 106 3.3 109 2.4 99 4.4 111 3.1 50 101 6.4 94 6.5 107 2.7 109 3.6 10-羟基喜树碱 0.5 86 4.4 93 2.8 83 6.6 106 3.5 5 113 6.3 110 2.4 96 3.5 103 3.9 50 90 2.7 102 5.7 114 2.7 105 3.1 乌头碱 0.5 89 5.1 105 5.3 107 6.3 90 3.4 5 116 2.9 111 2.9 93 5.9 111 2.7 50 100 3.6 103 2.6 119 4.6 105 3.5 钩吻碱 0.5 91 4.1 107 2.9 113 5.5 92 2.8 5 115 2.4 119 4.3 107 6.7 115 2.8 50 100 2.6 105 3.2 119 3.7 107 2.6 茄碱 0.5 97 3.2 101 4.2 89 6.1 115 2.7 5 106 3 104 2.7 93 2.9 92 6.7 50 89 2.8 102 3 104 2.3 106 5.5 本应用简报提供了一种简单前处理结合UHPLC/MS/MS 方法，能够同时测定葡萄酒、牛奶、面包和米粉中的18种生物碱。该方法具有出色的线性、较高的灵敏度、优异的准确度和精密度，并且操作简便、性能可靠，有望用于食品中这些生物碱的常规监测。 www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ( 2019年7月31日， 中国出版 ) ( 1. M eng， P . J. The P roperties of ToxicAlkaloids and Analysis. Chinese Journal of Chemical Bulletin 2010. 6 ， 484-489 ) 2. ( Commission Regulation (EU)2016/239. https：//publications.europa.eu/en/publication-detail/-/ publication/0f2d0cd3-d764-11e5- 8fea-01aa75ed71a1/language-en ) 3. ( C ommission R e gulation (EU)No 37/2010. https：//eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?qid=1561 467502930&uri=CELEX：320 1 0R0037 ) 查找当地的安捷伦客户中心： ( www.agilent.com/chem/contactus-cn ) 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn ( 4. 中华人民共和国农业部，动物性食品中兽药使用公告汇总，2017年3月 9日。ht t ps：//max.book118.com/html/ 2018/0912/8121000107001123.shtm ) ( 5. Jain， V. et al. Analysis of Alkaloidsin Areca Nut-Containing Productsby Liquid Chromatography-TandemMass Spectrometry[]. J. Agric.FoodChem. 2017，65(9)，1977-1983 ) ( 6. Lv， C. et al . Determination of Five Pyrrolidine Alkaloids in Honey by HPLC-MS/MS. Chin. J. 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