医药产品中聚合物土温 80检测方案(超临界色谱)

作者 安捷伦超临界流体色谱 (1260 SFC)-超高分辨质谱 (6540 QTOF) 联用技术在聚合物土温80 (Tween80) 分析的应用 应用 超临界流体色谱 (SFC) 高分辨质辨(HRMS) 聚合物 (Polymer)土温80(Tween80) 摘要 本应用报告采用 Agilent 1260 Infinity SFC 超临界色谱和 Agilent 6540 QTOF 超高分辨质谱系统建立对医药产品中聚合物土温80 (Tween80) 的分析技术。本研究基于 AgilentQTOF 精确质量及超临界色谱分离技术快速实现了医药产品中土温80分析，其中精确高分辨质荷比全扫描技术可以有效发掘土温80中不同聚合度 (n=17~32) 的存在形式和分布方式，超临界色谱则可解决反相色谱 C18分离困难的问题，利用正相分离机理有效的实现了不同聚合度土温80的分离测试， 同时 SFC 作为一种环保绿色分离技术也将成为经典色谱分析的有益补充。 药品是一种特殊商品，其药效与质量直接关系到人体健康和安全，药用辅料是药物制剂的基础材料和重要组成部分，是保证药物制剂生产和发展的物质基础，在制剂剂型和生产中起着关键的作用，其质量可靠性和多样性是保证剂型和制剂先进性的基础。土温80(Tween80) 是常见的乳化剂，由于其优良的乳化性能，在药物制剂特别是注射剂中应用广泛，但近年来国内外有因土温80质量问题或使用不当导致中药注射剂不良反应的报道。一般认为土温80是单一结构的物质，2009年出版的药用辅料手册对土温80的定义是聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，结构如图1。美国药典32版，《中国药典》都用此定义了土温80。也基于此开发了很多质量控制方法，如比色法， HPLC 法等。基于这种认识，有些研究把土温80出现的问题归咎于其原料纯度不够和杂杂质留。 本研究采用超临界流体色谱技术 (SFC) 配合2-乙基吡啶亚二微米填料色谱柱，可以解决土温80系列聚合度化合物的分离测试；另外与经典反相色谱流动相相比，超临界流体先天具有一个巨大的优势，黏性极低，同时扩散性增大，因此具有更好的传质性能。Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统可以使用更长的和/或小粒径填料色谱柱在不超过 600 bar 系统压力下工作，结合了UHPLC和 SFC的各自优势，从而可获得更高的性能。本应用报告有效的结合Agilent 超高分辨率四及杆串联飞行时间质谱6540 QTOF 和超临界流体色谱1260 Infinity SFC 技术应用于医药产品中聚合物土温80的分析检测，为进一步研究土温类聚合物的化学组成及安全性提供技术保障。 仪器 Agilent Infinity 1260 Analytical SFC 系统， 其中包括 SFC 控制模块，，二二元泵，自动进样器、二极管阵列检测器、真空在线脱气机和安装有六柱切换阀的柱温箱。 Agilent 6540 QTOF 质谱系统， MassHunter B 6.0采集软件和数据处理软件。 试剂 试剂 来源 备注 甲醇 DikmaPure HPLC 级 CO2 北京市北温气体制造厂 99.999% 乙腈 DikmaPure HPLC级 试样标准品 混合农残标液 标样制备 ( 取混合农药标准品适量，用异丙醇/甲醇 (1：1)配制成标准品溶液。 ) 图1. Tween80 结构式(其中n=10~32，n 平均值为20) 实验条件 色谱柱 2-乙基吡啶柱 3.0x100 mm 1.7 pm 流动相 A： C02 B：20 mM 甲酸铵甲醇 梯度 0-10 min B 10%-40% 流速 2 ml/min BPR 130 bar 柱温 45°C 进样量 3pl 补偿泵 0.2 ml/min 补偿泵流动相 20mM 甲酸铵甲醇 质谱条件： 极性： 正离子模式 (DualJetStream ESI) 干燥气温度： 150°C 干燥气流量： 16 L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 3500 V 喷嘴电压： 0V 鞘气温度： 300°C 鞘气流量： 11 L/min 扫描范围： 100-3000m/z 碎裂电压： 160V Skimmer： 65V 结果与讨论 通过分析土温80的合成过程，可以从理论上推测可能含有的组分。生产上土温80是用山梨醇酐与油酸及约20 mol 的环氧乙烷反应而制得。由于原料来源不同，生产工艺不同，使得土温80的化学组分及比例可能具有很大的差异。本研究拟以土温80主成分聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯[C24H4406(OC2H4)n]为目标， 确立其聚合度分布及分离鉴定。分别优化了1260 SFC 色谱柱类型，流动相梯度条件和补偿液组成等和6540 QTOF质谱参数，最终可在10 min 内完成土温80系列聚合物的高效分离，如图2和图3为吐温80的提取离子(EIC) 色谱图和质谱图。 图2. Tween80 (n=17~32) 在1260 SFC-6540 QTOF EIC 叠加图谱 图3. Tween80(n=17~32)在1260 SFC-6540 QTOF质谱叠加图谱 从上述谱图分析可以看出，土温80中聚氧乙烯聚合度分布从17至32，且依次随着聚合度增加色谱峰逐级展开分离，且各聚合度化合物质谱强度呈正态分布，在聚合度达到23时，其强度达到峰值。在各聚合度下化合物的质谱图均可同时监测到[M+H]+，[M+NH4]+，和[M+Na]+离子峰，由于补偿液中添加了甲酸铵，导致土温80均以[M+NH4]+离子为主峰，另外[M+Na]+强度较高，[M+H]+强度较弱，此离子强度分布与文献报道一致。图4是以聚合度为23的土温80的各加合离子质谱图。各聚合度精确质量偏差小于1 ppm， 显示了6540 QTOF 优异的质量测定精密度。 SFC 分离实验分别比较了包括 Rx-SIL 色谱柱，2-乙基吡啶色谱柱和氰基(CN)色谱柱对土温80的分离效果， 其中2-乙基吡啶色谱柱色谱分离度，色谱峰形和质量强度分布均效果最佳，所以实验最终确定2-乙基吡啶柱用于分析土温80。 结论 采用超临界色谱技术 (1260 Infinity Analytical SFC) 和超高分辨质谱技术 (6540 QTOF) 建立了医药产品中土温80的分析技术方法，高精确质量测定和超临界色谱为土温80复杂混合体系的分析提供的有效解决方案，可以预见此新型色质联用技术对进一步研究土温80成分组成分布及其质量安全评价提供了理想的技术支撑。SFC-MS联用技术为医药产品中聚合物分析检测和质量安全控制提供了有益的解决方案及选择方向。 ( 1. A.Christiansen， T.Backensfeld et al."Stability of the non-ionicsurfactant polysorbate 80 investigated by HPLC-MS andcharged aerosol detector"， P h armazie 66 (2011)： 666-671 ) ( 2. Zhang Rui， Wang Yu， et al."Analysis of the ChemicalComposition of Polysorbate 80"Chin Pharm J， (2012) 47：149-154 ) 更多信息 ( 本文仅代表典型的结果。更多有关我们产品和服务，请访问我们 的网站： www.agilent.com/chem/cn. ) www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年1月15日， 中国印刷 5991-3880CHCN Agilent Technologies 摘要本应用报告采用Agilent 1260 Infinity SFC 超临界色谱和Agilent 6540 QTOF 超高分辨质谱系统建立对医药产品中聚合物土温80 (Tween80) 的分析技术。本研究基于Agilent QTOF 精确质量及超临界色谱分离技术快速实现了医药产品中土温80 分析，其中精确高分辨质荷比全扫描技术可以有效发掘土温80 中不同聚合度(n=17〜32) 的存在形式和分布方式，超临界色谱则可解决反相色谱C18 分离困难的问题，利用正相分离机理有效的实现了不同聚合度土温80 的分离测试，同时SFC 作为一种环保绿色分离技术也将成为经典色谱分析的有益补充。前言药品是一种特殊商品，其药效与质量直接关系到人体健康和安全，药用辅料是药物制剂的基础材料和重要组成部分，是保证药物制剂生产和发展的物质基础，在制剂剂型和生产中起着关键的作用，其质量可靠性和多样性是保证剂型和制剂先进性的基础。土温80 (Tween80) 是常见的乳化剂，由于其优良的乳化性能，在药物制剂特别是注射剂中应用广泛，但近年来国内外有因土温80 质量问题或使用不当导致中药注射剂不良反应的报道。一般认为土温80 是单一结构的物质，2009 年出版的药用辅料手册对土温80 的定义是聚氧乙烯20 山梨醇酐单油酸酯，结构如图1。美国药典32 版，《中国药典》都用此定义了土温80。也基于此开发了很多质量控制方法，如比色法，HPLC 法等。基于这种认识，有些研究把土温80 出现的问题归咎于其原料纯度不够和杂质残留。本研究采用超临界流体色谱技术(SFC) 配合2-乙基吡啶亚二微米填料色谱柱，可以解决土温80 系列聚合度化合物的分离测试；另外与经典反相色谱流动相相比，超临界流体先天具有一个巨大的优势，黏性极低，同时扩散性增大，因此具有更好的传质性能。Agilent 1260 Infinity 分析型SFC 系统可以使用更长的和/或小粒径填料色谱柱在不超过600 bar 系统压力下工作，结合了UHPLC和SFC 的各自优势，从而可获得更高的性能。本应用报告有效的结合Agilent 超高分辨率四极杆串联飞行时间质谱6540 QTOF 和超临界流体色谱1260 Infinity SFC 技术应用于医药产品中聚合物土温80 的分析检测，为进一步研究土温类聚合物的化学组成及安全性提供技术保障。结论采用超临界色谱技术(1260 Infinity Analytical SFC) 和超高分辨质谱技术(6540 QTOF) 建立了医药产品中土温80 的分析技术方法，高精确质量测定和超临界色谱为土温80 复杂混合体系的分析提供的有效解决方案，可以预见此新型色质联用技术对进一步研究土温80 成分组成分布及其质量安全评价提供了理想的技术支撑。SFC-MS 联用技术为医药产品中聚合物分析检测和质量安全控制提供了有益的解决方案及选择方向。