《中国药典》2015版
3421通则
b 型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法
0731通则
蛋白质含量测定法
o 第二法 福林酚法 (1owry 法)
o 第三法 双缩脲法
o 第四法 2,2' -联喹啉 -4,4’ -二羧酸法 (BCA 法)
o 第五法 考马斯亮蓝法 (Bradford 法)
o 第六法 紫外 -可见分光度法
蛋白质及多糖的测定-紫外可见分光光度法 目标客户:疫苗研发、,企业 依据标准:中国药典2015版 检测方法简介: 《中国药典》2015版 3421通则 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 0731通则 蛋白质含量测定法 第二法福林酚法(1owry法) 第三法双缩脲法 第四法2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法(BCA法) )第五法考马斯亮蓝法(Bradford法) 第六法紫外-可见分光光度法 详见如下附录 仪器配置: 目前我们涵盖紫外-可见范围的型号都能满足以上应用 我们主要推荐三款仪器。销售人员可以根据客户的经费情况和竞争对手情况,选择推荐。 紫外可见分光光度计 Biomate 160 高清晰触摸屏,本机控制,包括生命科学应用软件包紫外可见分光光度计 Evolution201性能优异,光源3年年修,符合21 CFRPart11安全软件,可做3Q认证 紫外可见分光光度计 Evolution260 性能优异,可变带宽,光源3年保修,适用于生命科学的应用模块(含以上药典方法),符合21 CFR Part11 安全软件,可做3Q认证 如果有疑问,请咨询赛默飞世尔科技的销售经理或技术人员。 附录 3421 b 型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 本法系依据可溶性糖经无机酸处理脱水产生糖醛(戊糖)或糖醛衍生物,生成物能与酚类化合物缩合生成有色物质,以此测定多糖的含量。 试剂(1)0.1%三氯化铁盐酸溶液准确称取三氣化铁(FeC13·6H20)0.1g,放入清洁 的试剂瓶内,加盐酸100ml,待溶解后置2一8°C冰箱保存。 (2)地衣酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液称取地衣酚lg,放入10ml量瓶中,加95%乙醇至10ml。临用前配制。 (3)25ug /ml核糖对照品溶液 测定法 量取1ml水,加人5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液,混匀后再加人0.4ml地衣酚乙醇溶液,混匀。水浴5分钟后置冰浴,在波长670nm处测定吸光度,作为空白对照。 先将供试品用水稀释至核糖含量不髙于25ug/ml,作为供试品溶液,量取1.0ml自“加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起,同法操作。 分别取核糖对照品溶液0.1m 1、0.2ml、0.4ml、0.6m 1、0.8ml、1.0m1于10ml试管中,每管依次加水0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml,自“加人 5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起,同法操作。 结果计算 以核糖对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归,求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代人直线回归方程,求出供试品溶液的核糖含量。 供试品多糖含量(ug/ml)=a*n/0.41 式中a为供试品溶液的核糖含量,,t ug/ml; n为供试品稀释倍数 0731 蛋白质含量测定法 第二法福林酚法(lowry法) 本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu 2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度高,测定范围为20一250ug。但对本法产生干扰的物质较多,对双缩脲反应 产生干扰的离子,同样容易干扰福林酚反应,且影响更大。如还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 除另有规定外,按方法1操作;如有干扰物质时,除另有规定外,按方法2操作并需经方法学验证。 方法1: 试剂 碱性铜试液:取氢氧化钠10 g,碳酸钠50g,加水400ml使溶解,作为甲液;取酒石酸钾0.5g, 加水50ml使溶解,另取硫酸铜0.25g,加水30ml使溶解,将两液混合作为乙液。临用前,合并甲、乙液,并加水至500ml。 对照品溶液的制备:除另有规定外,取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品,加水溶解并制成每lml中含0.2mg的溶液。 供试品溶液的制备:照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定定:精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0. 6ml 、0.8ml、1.0ml(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至1.Otnl,再分别加入碱性铜试液1.0 ml,摇匀,室温放置10分钟,各加人福林酚试液[取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1一16]4.0 ml,立即混匀,室温放置30分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在650mn的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。 方法2: 测定前将脱氧胆酸盐-三氯醋酸加人样品中,通过将蛋白质沉淀来去除干扰物质。这种方法也可用于将稀溶液中的蛋白质浓度。 试剂 试液A取1%氢氧化钠溶液200ml与5%碳酸钠溶液200ml混合,加水稀释至500ml。 试液B取2.98%二水合酒石石二钠溶液100ml与1.25%硫酸铜溶液100ml混合,加水稀释至250ml,临用新制。 试液C取戏液A与与液B 按50:1的比例混合,临用新制。 福林酚试液取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1一2(所配得的福林酚试液应满足以下要求:取供试品溶液lml,加试液C5ml和配好的福林酚试液0.5ml,所得溶液的pH值应为10.3±0.3。若溶液pH值超出范围,应适当调整福林酚试液的稀释倍数)。 去氧胆酸钠试液取去氧胆酸钠适量,加水制成每lml中含1.5mg的溶液。 对照品溶液的制备 除另有规定外,取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品适量,加水分别制成每lml中含 0.00mg、0.0lmg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg的溶液(对照品溶液浓度可在本法测定范围内进行适当调整)。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定法: 精密量取各对照品溶液1.0ml,分别置玻璃试管中,加人去氧胆酸钠试液0.1m1,涡旋混匀,室温放置10分钟,加人72%三氣醋酸溶液0.1ml,涡旋混匀,在3000g条件下离心30分钟,轻轻倒出上清液,用吸管将剩余液体移除。蛋白质沉淀用试液Clml复溶后,再加入试液C5ml,混匀,室温放置10分钟,加人福林酚试液0.5ml,立即混匀,室温放置30分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在750nm的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液1.0ml,同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。 本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用 比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法快速、灵敏度低,测定范围通常可达1一10mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和某些氨基酸等。 试剂 双缩脲试液取硫酸铜1.5g、酒石酸钾钠6.0g和碘化钾5.0g,加水500ml使溶解,边搅拌边加人10%氢氧化钠溶液300ml,用水稀释至1000ml,混匀,即得。 对照品溶液的制备除另有规定外,取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品,加水溶解并制成每lml中含10mg的溶液。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定法: 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再分别加人双缩脲试液4.0ml,立即混匀,室温放置30分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在540mn的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法操作。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。 第四法2,2'-联喹啉-4,4'二羧酸法(BCA法) 本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+,2,2'-联喹啉二羧酸 (BCA)与Cu+结合形成紫色复合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度较高,测定范围可达80一400ug。本法测定的供试品中不能有还原剂和铜螯合物,否则干扰测定 试剂: 铜-BCA试液 取2,2'-联喹啉-4,4'二羧酸钠lg,无水碳酸钠2g,酒石酸钠0.16g,氢氧化钠0.4g与碳酸氢钠0.95g,加水使溶解成100ml,调节pH值至11.25,作为甲液; 另取4%硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液100ml,加入乙液2ml,混仨,即得。 对照品溶液的制备除另有规定外,取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品,加水溶解并制成每lml中含0.8mg的溶液 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本长一致)。 测定法: 精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5mK对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至0.5ml,再分别加人铜-BCA试液10.0ml,立即混匀,置37°C:水浴中保温30分钟,放冷,照紫外-可见分光光度法(通则0401),立即在562nm的波长处测定吸光度;;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀稀倍数,即得。 本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳 香族氨基酸结合形成蓝色复合物,在一;定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度高,通常可测定1一200ug 的蛋白质量。本法主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等,供试品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。 试剂: 酸性染色液取考马马亮蓝G2500.lg, 加乙醇50ml溶解后,加磷酸100ml,加水稀释至1000ml,混匀。滤过,取滤液,即得。本试剂应置棕色瓶内,如有沉淀产生,使用前需经滤过。 对照品溶液的制备除另有规定外,取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品,加水溶解并制成每lml中含lmg的溶液。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定法: 精密量取对照品溶液0.0ml、0.01ml. 0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.lm 1(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至0.1ml,再分别加人酸性染色液5.0ml,立即混匀,照紫外-可见分光光度法(通则0401),立即在595mn的波长处测定吸光度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定,从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,上即得。 【附注】本法测定时不可使用可与染色物结合的比色皿(如石英比色皿),建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。 第六法紫外-可见分光光度法 本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸,其在280nm波长处具最大吸光度,在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。 本法操作简便快速,适用于纯化蛋白质的检测,一般供试品浓度为0.2一2mg/ml。本法准确度较差,干扰物质多。测定法(2)适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白质测定。对照品溶液与供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。 测定法: (1)取供试品溶液,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在280nm的波长处测定吸光度,以吸收系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。 (2)取供试品溶液,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在280nm与260nm的波长处测定吸光度,按下式计算供试品中蛋白质的含量。 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45*A280-0.74*A260 《中国药典》2015版3421通则b 型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法0731通则蛋白质含量测定法o 第二法 福林酚法 (1owry 法)o 第三法 双缩脲法o 第四法 2,2' -联喹啉 -4,4’ -二羧酸法 (BCA 法)o 第五法 考马斯亮蓝法 (Bradford 法)o 第六法 紫外 -可见分光度法
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