葡萄酒中卤代苯甲醚检测方案(毛细管柱)

分析参数 作者 摘要 使用顶空-固相微萃取和气相色谱/三重四极杆质谱高效分析葡萄酒中亚 ng/L级的卤代苯甲醚 应用简报 食品 卤代苯甲醚污染会导致软木塞变质，从而使受影响的葡萄酒散发出一种霉味。每年，软木塞污染都会使葡萄酒及其相关行业遭受重大的经济损失。本研究将顶空-固相微萃取(HS-SPME) 与 Agilent 7890A 气相色谱和 Agilent 7000B三重四极杆质谱联用，对葡萄酒进行测定得到定量限(LOQ)， 其中 TCA为 0.5 ng/L。 TeCA、TBA 和 PCA的LOQ≤1.0ng/L。这些定量限均低于卤代苯甲醚在葡萄酒中的感觉阈值水平。本方法实现了完全自动化，仅需添加内标即可完成方法，萃取时间为 10 min，具有较高的分析通量。 Anna K. Hjelmeland、 Thomas S. CollinsAlyson E. Mitchell 和 Susan E. Ebeler葡萄栽培和酿酒系，食品科学与技术学院，农业与环境化学研究组和食品安全与计量设备 加州大学 加利福尼亚州戴维斯市 美国 Joshua L. Miles Treasury Wine Estates 600 Airpark Road 加利福尼亚州纳帕 美国 Philip L. Wylie 安捷伦科技公司 2850 Centerville Road 特拉华州威尔明顿 美国 即使在痕量水平下，卤代苯甲醚(例如2，4，6-三氯苯甲醚 (TCA)、2，3，4，6-四氯苯甲醚(TeCA)、2，3，4，5，6-五氯苯甲醚 (PCA) 和2，4，6-三溴苯甲醚(TBA))仍会使很多食品和饮料散发一种发霉的气味。在葡萄酒中，这种污染通常被称为软木塞污染，市场上大约有1%-5%的葡萄酒会受此影响，从而使经济遭受巨大的损失。尽管有时会涉及到橡木桶和酒庄其他相关来源，但葡萄酒中卤代苯甲醚污染的来源仍以受污染的软木塞为主。 卤代苯甲醚具有低至 ng/L范围的感觉阈值(葡萄酒中的TCA约为3ng/L)， 因此需要一种高灵敏度、高特异性的分析方法来定量分析葡萄酒中的卤代苯甲醚。大多数酒庄和软木塞供应商已建立了详细的质量控制分析程序，包括整个加工和储存过程中对软木堆和葡萄酒样品中卤代苯甲醚浓度进行的常规监测，因此需要一种高通量的分析方法。 很多卤代苯甲醚都通过 HS-SPME 方法进行分析，但因其萃取时间通常大于20 min，极大限制了生产环境中的分析速度。另外，很多方法都未使用稳定的同位素内标来保证定量分析的准确性。由于串联质谱(MS/MS)对目标分析物具有低检测限(LOD)(高灵敏度)和高选择性，因此常被用于葡萄酒成分的目标分析。本应用简报将介绍一种已发布的方法，使用 HS-SPME 和稳定的同位素内标在 Agilent 7890A 气相色谱仪和 Agilent 7000B 三重匹极杆气质联用系统上对卤代苯甲醚进行快速、准确且高重现性的MS/MS分析。最终得到的 TCA、TeCA、PCA 和 TBA的检测限和定量限均≤1 ng/L[1]。 实验部分 标准品和试剂 按照现有文献所述[1]，对卤代苯甲醚标准品进行采购并制备储备液。同时还按照现有文献准备了模拟葡萄酒，用于进行初步评估和校准样品的制备。 从当地购得5种市售葡萄酒(2种红葡萄酒和3种白葡萄酒)，用于回收实验。另外，还从当地检测实验室获得了5种消费者投诉有发霉气味的受污染葡萄酒[1]。 仪器 利用 Agilent 7890A 气相色谱仪与 Agilent 7000B 三重四极杆气质联用系统相结合，并在气相色谱仪的进样口处安装 SPME 进样衬管，进行方法开发。将一台 Gerstel MPS2 自动进样器安装在7890A 气相色谱仪上便于进行顶空萃取。表1列出了 GC/MS/MS仪器运行条件。 表1. 气相色谱及质谱条件 气相色谱条件 分析柱 30 mx0.25 mm， 0.25 pm DB-5(部件号122-5032) 进样口 不分流，配置 SPME 进样口衬管 进样 不分流； 1.2 min 后打开分流阀， 流速50 mL/min 保持3min， 然后将流速改为20 mL/min 载气 氦气，恒流，1.2 mL/min 柱温箱温控程序 在40°C 下保呆0 min 以30°C/min 升至280℃ 保持3 min 传输线温度 280°C 质谱运行条件 溶剂延迟 5 min EMV增益 15 采集参数 El， 多反应监测模式(MRM) 扫描宽度 ±1.2m/z 淬灭气体 氦气，2.25 mL/min 碰撞气体 氮气， 1.5 mL/min 样品前处理 将10mL 葡萄酒样品装入20mL琥珀色玻璃样品瓶中，再加入50pL 内标储备液。样品中内标物的最终浓度分别为 5.0 ng/L[H，] TCA 和[13C ] PCA， 10 ng/L [?H，]TBA。萃取前，先将样品在 40°℃ 下以 500 rpm 的速度搅拌5 min。然后将100 pm 预老化的 PDMS SPME 纤维头迅速插入顶空瓶中，在250 rpm 下搅拌10 min， 对样品进行萃取。之后将纤维头在280℃条件下在气相色谱仪进样口处进行热解吸，解吸时间与整个柱箱循环时间(11 min) 一致，以防止样品间残留污染。为了防止污染和样品损失，纤维头将始终置于色谱进样口处或者样品瓶中。对所有样品进行三次重复分析。 表2列出四种卤代苯甲醚的分析参数。 表2. 分析参数 分析物/内标 保留时间(min) 离子对(m/z) 三氯苯甲醚 (TCA) 5.21 210→195* 10 212→197t 10 [Hg]三氯苯甲醚 5.20 215→197 10 217→199 10 四氯苯甲醚(TeCA) 6.10 246→203 25 231→203 15 三溴苯甲醚(TBA) 6.50 344→329 10 346→331 10 [Hg]三溴苯甲醚 6.48 351→333 15 349→331 15 五氯苯甲醚(PCA) 6.91 265→237 10 280→237 25 [sc；]五氯苯甲醚 6.91 286→242 25 286→271 10 *在上表列出的所有离子对中，第一个为定量离子对t在上表列出的所有离子对中，第二个为定性离子对来源： Hjelmeland 等人[1] 结果与讨论 线性、LOD 和 LOQ 表3中的结果显示了模拟葡萄酒基质中每种卤代苯甲醚获得的线性响应。所得的各化合物的 LOD 和 LOQ均比各自的感觉阈值低很多。在这种分析条件下，挥发性最弱的分析物 TBA所测得的LOD 和 LOQ最高。本方法通过缩短萃取时间在最优灵敏度和高分析通量之之实现了权衡。本研究测得的 LOD 和 LOQ均低于早期出版的 HS-SPME 法分析水、葡萄酒以及软木萃取液中卤代苯甲醚的研究结果。这些早期研究也采用 HS-SPME方法，萃取时间≥25min， 同时使用单四极杆选择离子监测 (SIM) 表3. 卤代苯甲醚校准曲线以及通过模拟葡萄酒测得的线性、LOD与LOQ 分析物 (ng/L) 相关系数(R) (ng/L) (ng/L) (ng/L) TCA 0.10-50 0.9992 0.50 0.10 3.0 TeCA 0.10-50 0.9997 0.10 <0.10t 15 PCA 0.10-50 0.9996 0.25 0.10 3.0 TBA 0.50-50 0.9991 1.0 0.50 10000 *葡萄酒中的感觉阈值 t未分析浓度小于0.10 ng/L的标准品 来源： Hjelmeland 等人[1] 回收率和重现性 使用我们的研究方法测定红葡萄酒和白葡萄酒基质中卤代苯甲醚的回收率率90%-110%之间，多数样本的相对标准偏差(%RSD)小于10%(表4)。已有文献对类似数据进行过报道[2，4]。据报道，基质干扰会会制亚 ng/L级成分的检测，我们的串联质谱方法与 HS-SPME 相结合，在葡萄酒的分析中未出现基质干扰。当背景水平可被观察到时，根据离子丰度比可以确认卤代苯甲醚是否为污染源。在商用葡萄酒中检测到低浓度卤代苯甲醚并不意外，因为要彻底消除空气、水和玻璃器皿中的卤代苯甲醚污染是非常困难的。还需要对分析系统中的元器件污染进行监测。例如，使用高浓度校准溶液后，必须对系统内的塑料元件进行清洗，分析浓度超过100 ng/L的溶液后，应当将色谱柱前段(约2.5cm处)切割掉，以防止残留[1]。 表4. 葡萄酒中卤代苯甲醚的加标回收率和重现性 测定值 加标量 空白 加标后 加标回收率 RSD 分析物 葡萄酒 (ng/L) (ng/L) (ng/L) (%) TCA Petite syrah 50 nd* 0.94 4.7 Sauvignon blanc nd 0.93 4.8 Gewurztraminer 50 < LOQ 50 Riesling nd Cabernet sauvignon nd TeCA Petite syrah 50 0.7 110 Sauvignon blanc 50 nd 46 Gewurztraminer 50 nd 62 98 Riesling 50 nd 52 Cabernet sauvignon 50 nd 108 40 PCA Petite syrah 50 nd 36 Sauvignon blanc 50 nd 52 Gewurztraminer nd 53 28 Riesling nd 97 Cabernet sauvignon 50 nd 108 TBA Petite syrah 5 nd 109 Sauvignon blanc nd Gewurztraminer 50 nd 33 Riesling 50 nd 53 Cabernet sauvignon nd 7.7 7.3 *未检出，低于 LOD 来源： Hjelmeland 等人 [1] 受污染葡萄酒分析 对消费者投诉的受污染葡萄酒进行分析，结果表明TCA是检测到的最主要的卤代苯甲醚，其浓度水平接近或者超过报告的感觉阈值(表5，图1)。其他种类的卤代苯甲醚未被检出，或者检出浓度比 TCA 低 10倍左右。 图1.消费者所投诉的葡萄酒A的色谱图(表6)。 TCA 的计算值为 2.3 ng/L， 来源： Hjelmeland 等人[1] 表5..：三种受污染葡萄酒中卤代苯甲醚的浓度 测得浓度(ng/L)和(%RSD) 分析物 葡萄酒 A 葡萄酒B 葡萄酒C TCA 2.3 (4.5) 9.9(3.4) 6.8(5.6) TeCA 0.18(6.9) 0.16(0.7) 0.17 (3.5) PCA 0.41 (18) nd* 0.26(9.0) TBA nd* 0.65(1.8) 0.73(1.8) t来自商业实验室 *未检出，低于 LOD 来源： Hjelmeland 等人[1] 结论 使用 HS-HPME 和 Agilent 7000B 三重四极杆质谱开发了一种能快速、高通量分析葡萄酒中 TCA、TeCA、PCA 和TBA的方法。TCA、TeCA 和 PCA 的 LOD 和 LOQ均低于1 ng/L， TBA 的 LOD和L0Q≤1 ng/L。这些浓度均低于报告的感觉阈值，这对于葡萄酒生产的全程监测具有重要作用，可确保生产和储存过程中不会引入污染源导致葡萄酒产生霉味。方法优化后， HS-SPME 的萃取时间共计15 min， 其中包括5 min 的预搅拌时间。气相色谱分析时间为 11 min。 ( 参考文献 ) ( 1. A . K. H jelmeland， T. S. Collins， J. L . Miles， P. L. Wylie， A. E. Mitchell， S. E. Ebele r .“Determination of 2，4，6-Trichloroanisole and 2，4，6-Tribromoanisole in Wine Using M icroextraction i n Packed Syringe and GasChromatography-Mass Spectrometry."Am. J.Enol.Viticult. 63，494-499 (2012). ) 2. T.J. Evans， C.E. Butzke， S.E. Ebeler."Analysis of2，4，6-trichloroanisole in wines using solid-phasemicroextraction coupled to gas chromatography-massspectrometry."J. Chromatogr.，A 786， 293-298(1997). 3. C. Fischer and U. Fischer."Analysis of cork taint in wineand cork material at olfactory subthreshold levels bysolid phase microextraction."J. Agric. Food Chem. 45，1995-1997.(1997). 4. T.S. Collins， A. Hjelmeland， and S.E. Ebeler. "Analysis ofhaloanisoles in corks and wines."In Recent Advances inAnalysis of Food and Flavors. S. Toth and C.J. Mussinan(eds.)， pp. 109127. Am. Chemical Society， Washington，DC.(2012). www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 更多信息 C安捷伦科技(中国)有限公司， 2013 2013年12月31日，中国印刷 这些数据仅代表典型结果。有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn 5991-3812CHCN Agilent Technologies 卤代苯甲醚污染会导致软木塞变质，从而使受影响的葡萄酒散发出一种霉味。每年，软木塞污染都会使葡萄酒及其相关行业遭受重大的经济损失。本研究将顶空-固相微萃取(HS-SPME) 与Agilent 7890A 气相色谱和Agilent 7000B 三重四极杆质谱联用，对葡萄酒进行测定得到定量限(LOQ)，其中TCA 为0.5 ng/L。TeCA、TBA 和PCA 的LOQ ≤ 1.0 ng/L。这些定量限均低于卤代苯甲醚在葡萄酒中的感觉阈值水平。本方法实现了完全自动化，仅需添加内标即可完成方法，萃取时间为10 min，具有较高的分析通量。