畜禽产品中兽药检测方案(液相色谱仪)

采用安捷伦三重四极杆液质联用系统对畜禽产品中兽药多残留进行分析 应用简报 食品检测和农业 作者 摘要 李建中，王少珍，郭启雷， 胡楠，马鑫，薄涛 安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用安捷伦三重四极杆液质联用系统，建立了同时检测畜禽产品中52种兽药(包括磺胺、喹诺酮、大环内酯、激素和林可胺类等)的分析方法。此方法使用配有 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(薄壳型反相 C18填料) 的 Agilent1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，使用配有安捷伦喷射流(AJS) 电喷雾离子源和 iFunnel 离子传输聚焦技术的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统在正离子模式下进行监测。该方法在1-100 ng/mL 浓度范围内线性关系性良好，相关系数R≥0.990；在添加浓度为1pg/kg 时，各化合物峰面积稳定性在 0.5%-11.9%之间；定量下限可达到 0.1 pg/kg-2.0 pg/kg。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，表明所建立的方法能在20 min 内对畜禽产品中的52种兽药类目标化合物完成快速、高灵敏度的检测分析，完全满足法规监测要求。 前言 兽药残留是指食用动物在应用兽药(包括药物添加剂)后，蓄积或储存在动物细胞、组织、器官内，或进入动物乳汁及家禽蛋中的药物原型及其有毒理学意义的代谢物和药物杂质的统称1.2。近年来，随着兽药种类的快速增加，使用范围的快速扩大，以及消费者对食品安全问题及自身健康的日益关注，动物源性食品中兽药残留问题已成为国内外学者广泛关注的热点。由于兽药残留种类繁多、理化性质各异、样品中残留水平低，其分析过程具有形式多样(游离态/结合态)、基质复杂、干扰物质多(包括蛋白、脂质等)等特点，这些特点也成为兽药残留分析的技术难点。 目前，动物源性食品中兽药残留分析的主要技术手段之一是采用灵敏度高、特异性好的 LC/MS 技术，前处理方式多按药物性质和类别分类进行提取和净化。近年来，随着技术手段的不断进步， LC/QQQ技术在多兽药残留分析方面的应用取得了长足的进步。在样品处理方面，除了传统的固相萃取技术外，基质分散 (QuEChERS)、在线柱切换等技术的应用也大大提高了药物提取净化所覆盖的种类和范围13.6。 本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495三重四极杆液质联用系统，建立了同时快速检测畜禽产品中常见的52种兽药的可靠定量方法。该方法可以满足对畜禽动物组织中常见多种兽药残留的高通量快速监测。 实验部分 试剂与化学品 所有试剂和溶剂均为色谱纯或者分析纯级。甲醇和乙腈购自德国默克 (MERCK)。甲酸和乙酸铵购自美国 Sigma-Aldrich公司。所用实验用水为 Millipore Milli-Q超纯水系统现制备的高纯去离子水。混合标准品(10pg/mL) 由烟台杰科检测服务有限公司提供。 仪器 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，其由 下列部件组成： ( A g ilent 1 290 Infinity 二元泵 (G4220A) ) · Agilent 1290 Infinity 标准自动进样器 (G4226A) ·Agilent 1290 Infinity 自动进样器冷却器 (G1330B) · Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源和 iFunnel 离子 传输聚焦技术的 Agilent 6495 三重四极杆液关联用系统，在 正离子模式下进行检测。 采用 Agilent MassHunter 工作站软件(B.07版本)进行数据 采集和分析。 标准溶液配置 ( 使用时用乙腈：水(10：90) 混合溶剂对混合标准品进行适当的逐级稀释，从而得到浓度分别为1、5、10、20、50 ng/mL的混合标准溶液，临用新制。 ) 样品前处理 畜禽产品的样品前处理过程可参照《QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测猪肉中121种兽药》和《采用LC/MS/MS 结合改进的 QuEChERS 方法对动物源食品中的36种兽药进行筛查》8文中所述方法。 液相色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3.0x100 mm， 2.7 pm 柱温： 40°C 进样量： 2pL 自动进样器温度： 10°C 流动相： A) 含0.1%甲酸和2.5 mmol/L 乙酸铵的 水溶液 B)乙腈 流速： 0.4 mL/min 梯度程序： 时间 B% 0.0 5 1.0 5 6.0 20 10.0 40 15.0 98 17.5 98 停止时间： 18.0 min 后运行时间： 3.0 min 质谱条件 离子模式： 正离子 干燥气温度： 200°℃ 干燥气流量： 16 L/min 鞘气温度： 350°C 鞘气流量： 11L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 3000 V 喷嘴电压： 0 V △EMV： 300V MS和 MS分辨率： 单位分辨率 MRM 参数： 如表1所示 表1.化合物 MRM 参数列表 化合物 母离子 子离子 碎裂电压 碰撞能量 碰撞池加速器电压 保留时间 (m/z) (m/z) (V) (V) (V) (min) 地塞米松 393.1 355 380 5 3 11.53 (Dexamethasone) 147 25 氟甲喹 262 244 380 15 3 11.54 (Flumequine) 202 30 氯丙嗪 319.2 246 380 20 3 12.22 (Chlorpromazine) 86 15 吡喹酮 313 203 380 10 3 12.78 (Praziquantel) 83 20 氟尼辛 297.2 279 380 20 3 13.06 (Flunixin) 264 30 仲丁威 208.2 152 380 5 3 13.31 (Fenobucarb) 95 10 群勃龙醋酸酯 313 271 380 20 3 14.18 (Revalor-H) 253 结果与讨论 如图1所示，采用配有 Poroshell 120 EC-C18色谱柱(薄壳型填料，3.0x100 mm，2.7 um)的安捷伦三重四极杆液质联用系统，可在20min 内对 1 ng/mL 混合标准溶液中52种兽药进行有效分离，且分离效果及峰形均能满足方法要求。Poroshell 120 EC-C18色谱柱具有较高柱效、较低柱压和较高载样量等特点，非常适合分析畜禽样品基质中的多药物残留。流动相中添加了0.1%甲酸和2.5 mmol/L乙酸铵，可以有效促进正模式下的离子化效率。 通过S/N≥10，计算得到52种兽药的定量下限均在0.1-2.0 pg/kg 之间，完全满足动物源性食品中多兽药残留的限量检测要求。 图1.52种兽药混合标准溶液(1ng/mL) 的 MRM 叠加图 6495三重四极杆液质联用系统可充分满足兽药多残留检测的要求，如表1所示为各兽药的 MRM 参数列表，其中给出了碎裂电压参考值。6495的新型预四极杆离子传输聚焦技术、弯曲锥形碰撞池、以及高能电子倍增管检测器设计，可以大大提高离子的聚焦传输，产生更有效的离子碎片和更高的离子/电子转化率，从而大大提高了检测灵敏度、稳定性及抗污染能力。 采用本文所述方法在浓度范围1-100 ng/mL 内对52种兽药的线性相关性进行讨论。结果表明，所有化合物在此浓度范围内具有良好的线性相关性，相关系数R均大于0.990，分别以奥喹多司、氯吡多、诺氟沙星、磺胺对甲氧嘧啶、泼尼松龙和泰洛星为例，如图2所示。 奥喹多司 )61y=10728.048907*x-1554.497898 氯吡多 x1 R^2=0.99875126 x106-y=65908.051312*x+7208.980143 R^2=0.99893778 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 浓度 (ng/ml) 浓度(ng/ml) 图2.奥喹多司、氯吡多、诺氟沙星、磺胺对甲氧嘧啶、泼尼松龙和泰洛星的标准曲线(1 ng/mL-100 ng/mL) 在鸡肉基质提取液中添加1 pg/kg 浓度的混合标准溶液，连续进样10针，进行方法稳定性讨论。如图3所示，在低浓度添加水平下，52种兽药的峰面积 RSD 值均在0.5%-11.9%之间，完全满足测试的稳定性要求。 图 3.1 ug/kg 添加浓度下连续进样10针所得 TIC 叠加色谱图 结论 本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495三重四极杆液质联用系统成功实现了对畜禽产品中52种多兽药残留的高灵敏度、快速、稳定的定量分析。本方法各项参数完全满足动物源性食品中多兽药残留的限量检测要求和快速检测。 ( 参考文献 ) ( 1. 中华人民共和国农业部公告第193号：食品动物禁用的兽 药及其它化合物清单 ) ( 2. 中华人民共和国农业部公告235号：动物性食品中兽药最 高残留限量 ) 3.Clara Boix ect. Qualitative screening of 116 veterinary drugsin feed by liquid chromatography-high resolution massspectrometry： Potential application to quantitative analysis.Food Chemistry，2014，160：313-320 4. George Stubbings ect. The development and validation ofa multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) procedure for determination of veterinarydrug residues in animal tissue using a QuEChERS approach.Analytica Chimica Acta， 2009， 637：68-78 ( 5. 孙兴权等.动物源食品中兽药残留高通量快速分析检测技 术.农业工程学报，2014，30：280-292 ) ( 6. 高洁等.兽药残留检测技术研究进展.食品安全质量检测学 报，2013，4：11-18 ) ( 7. 郭海霞等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测 猪肉中121种兽药.色谱，2015，33：1242-1250 ) 8.孙小兰等.采用 LC/MS/MS 结合改进的 QuEChERS 方法对动物源食品中的36种兽药进行筛查.安捷伦科技，5991-0013CHCN 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年08月06日，中国印刷 5991-7206CHCN Agilent Technologies 摘要    本文采用安捷伦三重四极杆液质联用系统，建立了同时检测畜禽产品中 52 种兽药（包括磺胺、喹诺酮、大环内酯、激素和林可胺类等）的分析方法。此方法使用配有 Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（薄壳型反相 C18 填料）的 Agilent1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，使用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源和 iFunnel 离子传输聚焦技术的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统在正离子模式下进行监测。该方法在 1-100 ng/mL 浓度范围内线性关系性良好，相关系数 R2 0.990；在添加浓度为 1 g/kg 时，各化合物峰面积稳定性在 0.5%-11.9% 之间；定量下限可达到 0.1 g/kg-2.0 g/kg。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，表明所建立的方法能在 20 min 内对畜禽产品中的 52 种兽药类目标化合物完成快速、高灵敏度的检测分析，完全满足法规监测要求。前言    兽药残留是指食用动物在应用兽药（包括药物添加剂）后，蓄积或储存在动物细胞、组织、器官内，或进入动物乳汁及家禽蛋中的药物原型及其有毒理学意义的代谢物和药物杂质的统称[1,2]。近年来，随着兽药种类的快速增加，使用范围的快速扩大，以及消费者对食品安全问题及自身健康的日益关注，动物源性食品中兽药残留问题已成为国内外学者广泛关注的热点。由于兽药残留种类繁多、理化性质各异、样品中残留水平低，其分析过程具有形式多样（ 游离态/结合态）、基质复杂、干扰物质多（包括蛋白、脂质等）等特点，这些特点也成为兽药残留分析的技术难点。结论    本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用系统成功实现了对畜禽产品中 52 种多兽药残留的高灵敏度、快速、稳定的定量分析。本方法各项参数完全满足动物源性食品中多兽药残留的限量检测要求和快速检测。