茶叶中五氯硝基苯农残检测方案(通用色谱配件)

用户投稿 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163应用文集 改进的 QuEChERS-GC/MS快速分析茶叶中 30 种农药残留 建立了茶叶中30种农药的快速分析方法。以 0.1%乙酸的乙腈(V/V)作为溶剂， AgilentBond Elut 提取试剂盒对样品进行1min 提取后，用 C1g 和 Agilent Bond Elut 净化试剂盒净化，用10mL 0.1%乙酸的乙腈与甲苯(体积比 3：1)洗脱，气相色谱-质谱 (GC-MS)检测。30种农药的检测限(LOD)为 0.03 pg/kg (氟草胺)~13 pg/kg (苯胺灵)。采用力标法定量，添加回收试验结果表明：30种农药的平均回收率为 74%~108%，相对标准偏差为0%~10.38%。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农药残留测定的技术要求。 前言 当今世界，经济全球化、贸易自由化进程日益加快，在这种背景下，世界各国对农产品和食品中要求检测的农药、兽药残留项目越来越多。我国是茶叶生产大国和贸易大国之一，但是，近几年发达国家规定的茶叶的检测项目不断增加，欧盟2003年的新标准中规定了193种农药项目，比2001年颁布的标准又增加了59项，日本在2003年的新标准中规定了121种农药项目叫。另外，欧盟、德国、日本等国家和地区还对标准中未列出的其他农药作了相应规定，这就大幅度扩大了茶叶的检测项目，而目前有关茶叶中农残的检测已有报道I2-11]，但检测的农药数量有限，而且只能针对某一类的农药，即便是有茶叶中多农残检测的，也是分别净化，分别进样的，并且不使用质谱检测器，无法对阳性样品确证，无法满足国外越来越多、越来越严格的茶叶检测项目。本文用乙腈和 Agilent Bond Elut 提取试剂盒一次性提取1min， 使用 Cig 和 Agilent Bond Elut 净齐试剂盒净化，用质谱检测器进行检测，具有简便、快速、回收率及净化效果良好，定性准确等特点。 1实验部分 1.1仪器与试剂 仪器： Agilent 7890A-5975C 气相色谱-质谱仪；高速离心机(BECKMAN COULTER)； 涡旋混合器 (IKA VORTEX)；振荡器(IKA-WERKE)； 旋转蒸发仪 (BUCHI)。 农药标准品： Etrimfos (乙嘧硫磷)、 Dichlobenil (敌草腈)、 Biphenyl(联苯)、Profam (苯胺灵)、 Tecnazene (四氯硝基苯)、Ethoprophos(灭克磷)、Benfluralin (氟草胺)、Alpha-HCH(α-六六六)、 Beta-HCH(B-六六六)、 Propazine (扑灭津)、Quintozene (五氯硝基苯)、Terbutylazin (特丁津)、Trietazine(草达津)、Delta-HCH(8-六六六)、Dichlofenthiol (除线磷)、 Propiscochlor (异丙草胺)、Prometryn(扑草净)、Prosulfocarb(苄草丹)、Pirimiphos-methyl (甲基嘧啶磷)、Metolachlor (异丙甲草胺)、Chlorpyrifos (毒死蜱)、Chlorthal-di-methyl (氯钛酸二甲酯)、 Fenson(除螨酯)、 Diphenamid(草乃敌)、Dimethametryn (异戊乙净)、Bromophos-ethyl (乙基溴硫磷)、Pa-clobutrazol (多效唑)、Profenofos (丙溴磷)、Buprofezine (噻嗪酮)、Azaconazole(氧环唑)、Flusilazole(氟硅唑)购自 Sigma-Aldrich。乙腈(HPLC)； 乙酸(美国 Fisher 公司)、甲苯为分析纯；水为超纯水；Agilent Bond Elut 提取试剂盒 (6g MgS0j， 1.5g NaAC) 与 AgilentBond Elut 净化试剂盒(400mg PSA， 400mgGCB， 1200mgMgSO)；C18填料。 标准储备液的制备：准确称取每种农药标准品 0.0100g (有效成分) 于10mL容量瓶内，用乙酸乙酯定容至刻度，得1000 mg/L的标准储备液，保存于冰箱中。 混合农药标准储备液：根据上述30种农药在仪器上的响应值分别准确移取各种农药标准品适量，用0.1%乙酸的乙腈配置成混合标准储备液(各种农药的质量浓度见表3)，保存在冰箱中，使用时根据实际需要配置成不同浓度的标准工作液。 1.2样品前处理 样品制备：取代表性样品约250g，用粉碎机粉碎，混匀，装入洁净的容器内，密闭并标明标记于4℃以下保存。提取：称取5g(精确至0.01g)试样，置于50mL离心管中，加入10 mL水，摇匀，再加入10 mL 0.1%乙酸的乙腈，混合均匀，加入 AgilentBond Elut 提取试剂盒，迅速涡旋1min， 振荡提取 1min， 8000r/min 离心 3 min，取上清液6mL。净化：将提取液加入含有0.48g Cig的50mL离心管中，加入24mL 水，振荡 1min， 3000r/min 离心 3 min，弃去液体层，向离心管中加入7.5 mL 0.1%乙酸的乙腈和2.5mL甲苯后加入 Agilent Bond Elut 净化试剂盒，振荡1 min， 8000 r/min 离心3 min ， 取上清液 6mL， 38℃减压浓缩至近干，氮气吹干，用0.1%乙酸的乙腈溶解并定容至 0.8 mL，供测定。 1.3气相色谱条件 色谱普： DB-5MS 毛细管色谱柱(30mx0.25 mm×0.25 pm)；柱温升温程序： 40°C(1 min) 30C/min 130 ℃ (0 min) 5°C/min280 ℃(5 min)； 进样口温度：290℃；气气：氦气，纯度≥99.999%， 流速1.2 mL/min；进样量：1.0pL；进样方式：不分流进样，1.5 min 后打开分流阀。 1.4质谱条件 电离方式：EI；电离能量：70ev；测定方式：选择离子监测方式(SIM)；离子源温度：230C；四级杆温度：150C；传输线温度：280°C；溶剂延迟： 5 min。各化合物的特征离子见表1。 用户投稿 表1测定30种农药的保留时间、定量离子、定性离子及分组参数 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 2结果与讨论 2.1提取方法的改进 与传统的提取方法相比， QuEChERS法具有快速、容易、便宜、有效、稳定和可靠的特点，特别在节约时间、溶剂方面表现的尤为突出，加入了分散剂和缓冲盐后，使体系分散均匀，分层效果好。所以， 选择用 QuEChERS 法进行提取。 茶叶中含有大量的色素，同时检测的农药种类较多，极性差异较大，因而对样品的前处理要求较高。考虑到二氯甲烷为含氯的有机溶剂且沸点低(39°C)，对实验室人员和环境污染较大，因此不考虑用二氯甲烷作溶剂。分别用乙腈，丙酮，乙酸乙酯作为溶剂进行提取，通过添加回收率实验发现乙酸乙酯的回收率不稳定，丙酮和乙腈的添加回收率都能满足要求，但是，丙酮提取的杂质较多，颜色深，在色谱图上杂质峰多。因此我们选择乙腈作为提取试剂，并且在其中加入0.1%的乙酸来掩蔽色谱系统的活性点I12]，以改善峰型和响应值。 2.2净化方法的改进 由于茶中含有大量的水溶性杂质(如茶多酚，茶碱等)[101，通过实验发现可以使用C18净化剂，将乙腈提取液中的农药吸附在 C1g上，然后在乙腈提取液中加入水，以去除水溶性杂质。同时，茶叶中含有大量的色素及其他杂质，影响测定。可以使用 AgilentBond Elut 净化试剂盒净化茶样品，其中的石墨化碳黑(GCB)净化剂可以除去大部分色素， PSA 是用来除去有机酸，色素和金属离子的净化剂，净化效果良好，对检检没有干扰。 首先，对水的用量进行了考察，分别加入6mL、12mL、18mL、24 mL、30 mL 的水进行实验，结果表明当加水量少时，农药的回收率低，加入 6mL水时，只有氟草胺的回收率>60%，其他农药的回收率都<50%，随着水量的增加，农药的回收率有明显的提高，当水和乙腈的体积比为4：1时，农药的回收率可以满足检测要求，当水量继续增加时，回收率没有明显的提高，乙基溴硫磷，异戊乙净等农药的回收率还有些微的下降。这是因为当水的比例较小，乙腈的比例较大时，一些农药被洗脱下来，影响回收率，当水的比例逐渐增加时，洗脱液主要以水为主，不影响农药的吸附，而大部分杂质被洗下来，当水量继续增加时，有一些微溶于水的农药，会有一定的损失，从而影响回收率，所以确定乙腈和水的比例为 4：1 即24mL 水。 接着考察了洗脱溶剂， GCB的吸附性较强，仅用乙腈溶液洗脱，大部分农药的回收率无法满足检测要求，所以，在乙腈中加入了不同比例的甲苯进行洗脱，用10mL的洗脱溶剂，乙腈：甲苯的体积分别为9：1、4：1、3：1、7：3，其中，敌草腈、联苯的回收率在乙腈：甲苯为4：1时在70%以上，其他农药在乙乙：甲苯为3：1时回收率满足要求，当甲苯比例继续增加时，洗脱下来的色素等杂质的增多，净化效果不好，干扰测定。所以确定洗脱时乙腈和甲苯的比例为3：1。 2.3检测条件的优化 在色谱柱选择过程中，发现文献报道的分离多农残色谱柱主要有DB-5MS 毛细管色谱柱和 DB-1701 毛细管色谱柱[13-17]。本实验分别选用 DB-5MS 和 DB-1701 毛细管色谱柱对多种农药进行分离，实验结果发现 DB-5MS 毛细管色谱柱的分离效果较好，且柱流失小，故本方法选用 DB-5MS 毛细管色谱柱。为了保证30种农药得到充分分离，采用程序升温的色谱条件。对进气化温度进行了考察，以多效唑为例，其他条件相同的情况下，仅改变进样口温度，从表2可以看出进样口温度从250℃起，随着温度的升高，多效唑的响应值在不断的增加。这是因为当气化温度低时，气化不完全，随着温度的升高，农药气化的量逐渐增加，响应值逐渐增加。在保证进样口正常工作的情况下，选择进样口温度为290°C。 表2不同汽化温度下多效唑的响应值 Inlet tepperature(℃) Response of paclobutrazol 250 344850 260 556761 270 782506 280 871289 290 1108280 2.4GC-MS的色谱行为 30种农药混合标准溶液的总离子流图见图1，空白茶叶样品中添加0.025mL标准溶液后，每种农药的提取离子色谱图见图2。 2.5标准曲线、线性范围及检出限 在优化的实验条件下测定了30 种农药标准品的线性范围、回归方程、相关系数及检出限，结果见表3.其中， r>0.999的有26种，其余四种的r>0.994， 表明21种农药在0.005-0.5mg/L范围内，另外8种农药在0.01-1.0 mg/L范围内，联苯在 0.0025-0.25范围内，峰面积Y与质量浓度X(mg/L)的线性关系良好。 2.6精密度与回收率 在空白茶叶样品中分别添加 0.025 mL， 0.05 mL， 0.125 mL 农药混合标准溶液，静置1h，使各农药标准品被茶叶充分吸收，按上述前处理和检测方法测定。使用空白基体萃取液配制基质标准溶液以补偿基体效应。每个添加浓度重复6次，计算各种农药的回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表4.试验中通过添加高、中、低三个水平农药标准溶液来测定各种农药的回收率。各种农药的检出限根据3倍信噪比计算得出(见表2)， 实验结果表明：30种农药的平均回收率范围为 74%~108%， RSD 范围为：0%~10.38%，准确度和精密度均达到农药残留分析的要求。 图1混合标准溶液的总离子流图 g- 图2空白茶叶样品中添加0.025mL 标准溶液的提取离子色谱图 表330种农药的线性范围、线性方程、相关系数、最小检出量和标准储备液中各农药标准品的质量浓度 1) peak No. in Fig. 1； 2)Y： peak area； X： mass concentration； 3)S/N=3： 4) initial mass concentration of the nasticide 安捷伦样品制备选择指南及应用文集 用户投稿 表4空白茶叶样品中30种农药的加标回收率(n=6) Spiked level 1 Spiked level 2 Spiked level 3 No. Pesticide c/ (mg/kg) R/%FRSD/% c/ (mg/kg) R/% F RSD/% c/ (mg/kg) R/%F RSD/% 1 dichlobenil(敌草腈) 0.01 0.75 4.81 0.02 0.76 4.00 0.05 0.87 3.83 2 biphenyl (联苯) 0.005 0.94 4.28 0.01 0.94 4.94 0.025 0.96 3.16 3 Profam (苯胺灵) 0.02 0.84 9.73 0.04 0.88 6.28 0.1 0.87 5.27 4 tecnazene(四氯硝基苯) 0.01 1.05 10.38 0.02 0.93 4.64 0.05 0.96 3.62 5 ethoprophos (灭克磷) 0.01 1.05 7.72 0.02 0.90 4.47 0.05 0.96 4.25 6 benfluralin(氟草胺) 0.01 1.03 3.89 0.02 1.08 2.10 0.05 1.00 1.94 7 alpha-HCH (a-六六六) 0.01 0.85 6.66 0.02 0.95 4.04 0.05 0.92 5.13 8 beta-HCH(β-六六六) 0.02 0.94 5.78 0.04 0.97 3.57 0.1 0.96 2.35 9 propazine (扑灭津) 0.01 0.76 4.16 0.02 0.74 3.43 0.05 0.79 1.71 10 quintozene (五氯硝基苯) 0.02 0.84 9.70 0.04 0.86 4.75 0.1 0.87 3.98 11 terbutylazin (特丁津) 0.01 0.86 3.91 0.02 0.83 3.29 0.05 0.87 1.39 12 trietazine (草达津) 0.01 0.89 9.81 0.02 0.88 5.41 0.05 0.92 4.42 13 delta-HCH (8-六六六) 0.02 0.78 5.05 0.04 0.94 2.79 0.1 0.97 2.69 14 dichlofenthiol (除线磷) 0.01 0.90 7.29 0.02 0.91 2.59 0.05 0.88 3.86 15 propiscochlor (异丙草胺) 0.01 0.92 7.26 0.02 0.99 3.97 0.05 1.07 1.76 16 prometryn (扑草净) 0.01 0.85 6.22 0.02 0.90 3.87 0.05 0.99 2.98 17 prosulfocarb (苄草丹) 0.01 0.88 3.83 0.02 1.00 2.63 0.05 1.01 2.07 18 pirimiphos-methyl(甲基嘧啶磷) 0.01 0.99 7.12 0.02 0.98 2.93 0.05 1.00 0.00 19 metolachlor(异丙甲草胺) 0.01 0.94 6.99 0.02 0.94 2.30 0.05 0.99 1.76 20 chlorpyrifos (毒死蜱) 0.01 0.84 9.27 0.02 1.00 4.78 0.05 1.01 4.12 21 chlorthal-dimethyl (氯钛酸二甲酯) 0.01 1.06 4.16 0.02 0.99 3.49 0.05 1.00 1.76 22 fenson (除螨酯) 0.01 1.06 2.70 R： average recovery； RSD： relative standard deviation. 本文对 QuEChERS 农药多残留分析方法在茶叶提取及净化过程中的应用进行了改进，使用 Agilent Bond Elut 提取试剂盒与净化试剂盒，简化了操作步骤，缩短了分析时间，提高了方法灵敏度和基质净化效果，具有良好的准确度和精密度，应用于日常检测缩短检测周期。本文未涉及的其它农药化合物，也同样可以考虑用此方法进行检测。 ( 参考文献 ) ( [1]陈宗懋.我国出口茶农药残留现状和2003年国外新标准.茶叶 经济信息，2003.(3)：26. ) ( [2]楼国柱，白晓荣，徐等等.茶叶中7种有机磷农药残留的快速检测方法.食品科学， 2004，25(9)：159~161. ) ( [3]杨琳，陈妾，叶江雷等.固相萃取净化一气相色谱法同时测定茶 叶中16种有机氯、拟除虫菊醋农药残留.分析仪器， 2007，(1)：39~42. ) ( [4]叶江雷，弓振斌，林芳等.茶叶中水胺硫磷、亚胺硫磷 、 甲基对 硫磷和伏杀硫磷农药残留的高效液相色谱法测定.厦门大学学 报， 2007，46(3)：441~444. ) ( [5]叶江雷，陈銮，弓振斌等. 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