清热解毒类中成药中非法添加的化学药品对 乙酰氨基酚检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923907中国药事2009年第23卷第9期 药品检验·药品质量 HPLC 法同时检测清热解毒类中成药中非法添加的9种化学药品 宁素云，郭兴杰1*，，张 虹，郭冬梅，，刘 瑞”(山西生物应用职业技术学院，太原030031： 沈阳药科大学； 山西省药品检验所) 摘要： 目的建立同时检测清热解毒类中成药中非法添加的9种化学药品(阿司司林、对乙酰氨基酚、头孢氨苄、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氨基比林、芬布芬、双氯芬酸钠、布洛芬)的高效液相色谱法。方法采用 RESTEK C18色谱柱，流动相为乙腈-0.05mol·L乙酸铵溶液，梯度洗脱；流速0.8mL·min；检测波长 230nm；柱温：40℃。结果9种对照品在较宽的浓度范围内，峰面积和浓度有良好的线性关系r≥0.9995)。检出限为0.3~8.8ng，定量限为1.0~30ng。结论该法简单，重复性好，可同时检测中成药中是否非法添加有上述9种化学成分。 关键词： HPLC； 中成药；非法添加 中图分类号：R284.1； R917 文献标识码：A 文章编号：1002-7777(2009)09-0907-04 Detection of 9 Illegal Components in Traditional Chinese Medicine by HPLC Ning Suyun， Guo Xingjie *， Zhang Hong， Guo Dongmei and Liu Rui (Shanxi Biological ApplicationVocational Technical College， Taiyuan 030031；Shenyang Pharmaceutical University；’Shanxi Institute forDrug Control) ABSTRACT： Objective A HPLC method for the detection of 9 illegal components (aspirin， paracetamol，cefalexin， sulfamethoxazole， trimethopim，aminophenazone， fenbufen， diclofenac sodium and ibuprofen)in Traditional Chinese Medicine(TCM) was developed in this paper. Methods The analysis was performedon a RESTEK C8 column. A mixture of acetonitrile-0.05mol·Lammonium acetate aqueous solution wasused as the mobile phase under the program of gradient elution at a flow rate of 0.8mL·min. Thedetection wavelength was set at 230nm and the column temperature was 40℃. Results Good linearity wereobtained for the 9 components in a wide range and the correlation coefficients were greater than 0.9995.The LOD and LOQ were 0.3~8.8ng and 1.0~30ng， respectively. Conclusions The method is simple andrepeatable. It can be used to identify the 9 illegal components in TCM at the same time. KEY WORDS. HPLC；Traditional Chinese Medicine；illegal components 中成药中非法添加化学药的现象时有发生，患者在不知情下长期服用此类“中成药”，将产生不可预知的严重不良反应[1-8]。清热解毒类中成药所占市场份额较大，更容易为不法厂商所利用添加化学药品。本文选择了该类中成药中容易非法添加的阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢氨苄、磺胺甲噁 唑、甲氧苄啶、氨基比林、芬布芬、双氯芬酸钠、布洛芬9种化学药品作为检测对象进行研究。鉴于目前文献中除对乙酰氨基酚用化学方法、薄层色谱法、高效液相色谱法和质谱法检测检101外，检查此类中成药中其它8种化学药品的方法均未见报道，本试验建立了同时检测清热解毒类中成药中非 ( 作者简介：宁素 云 ，硕士，讲师；研究方向：药物分 析 ； Tel： 1 3994217206； E-mail： n i ngsuyun@soju. com ) ( 通讯作者：郭兴杰，博士生导师，教授；研究方向：药物分析； Tel： (024)23986285； E-mail： gxjhzy@yahoo. com. cn ) 法添加此9种化学药品的高效液相色谱法，并利用此方法检测了20种(批)具有清热解毒作用的中成药。采用本文建立的方法，可以使掺伪的检出更简单、更系统。 1 仪器与试药 1.k 仪器 岛津 LC-2010A 液相色谱仪； LC-Solution 色谱工作站； Precisa 92SM-202A-DR-SCS型电子分析天平(上海电光仪表设备有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗机(工作频率为40KHz，超声电功率为500W， 昆山市超声仪器有限公司)；80-1型离心沉淀机(上海荣泰生化工程有限公司)； XK96-B型快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司)。 1.2 试药 乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙酸铵(分析纯，天津市大茂化学试剂剂)；甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；水为二次蒸馏水。 阿司匹林(批号：100027-200101)、对乙酰氨基酚(批号：100018-200408)、头孢氨苄(批号：100045-200305)、磺胺甲噁唑(批号：100025-199503)、甲氧苄啶(批号：100031-200304)、氨基比林(批号：100503-200301)、芬布芬(批号：100415-200301)、双氯芬酸钠(批号：100334-200302)和布洛芬(批号：100179-200303)(以下顺序同)对照品(中国药品生物制品检定所)。 市售的20种(批)具有清热解毒功效的中成药为：某颗粒剂(批号：060712)、感冒清热颗粒(北京同仁堂科技发展股份有限公司，批号：060206)、感冒清热颗粒(承德颈复康药业，批号：20061001)、抗病毒颗粒(四川光大制药有限公司，批号：20050202)、感冒清热颗粒(天津和治药业，批号：20050702)、羚羊感冒胶囊((山西黄河有限公司，批号：051101)、清热消炎宁胶囊(广州敬修堂药业股份有限公司，批号：20050807)、羚羊感冒胶囊(黑龙江天宏药业，批号：051201)、三黄片(山西亚宝药业集团股份有限公司，批号：040602)、牛黄解毒片(广西世彪药业有限公司，批号：070106)、黄连上清丸(山西黄河中药厂，批号：050901)、羚翘解毒丸(山西省榆社阿胶厂，批号：050903)、清咽片(山西天星制药有限公司，批号：060509)、牛黄解毒片(河南省济源市济世药业有限公司，批号：051011)、清热解毒口服液 (江西汇仁药业有限公司，批号：051109)、银黄口服液(山西太行药业股份有限公司，批号：060201)、穿心莲片(山西旺龙药业，批号：060809)、板蓝根颗粒(河南省苑西制药股份有限公司，批号：050601)、板蓝根颗粒(广州白云山中药厂，批号：040910)、清咽片(天津同仁堂，批号：070205)。 2实验方法 2.1 溶液制备 混合对照品溶液 用甲醇作溶剂分别制备9种药物的对照品贮备液。分别精密吸取9种药物对照品贮备液适量，用甲醇稀释制成浓度分别为0.12，0.12，0.1，0.32，0.064， 0.06，0.12，0.01，0.08mg·mL的混合对照品溶液。 供试品溶液取一次剂量的中成药研细(胶囊剂连壳研；片剂连糖衣研)，置250mL量瓶中，加甲醇适量(胶囊剂先加少许热水使囊壳溶解)，摇匀，超声10min，加甲醇至刻度，摇匀，离心10min (4000 转· min)， 过0.45um滤膜。 2.2 色谱条件 色谱柱为 RESTEK Ci8 柱 (4.6mm×250mm，5um)， Ci8保护柱；流动相为乙乙-0.05mol·L醋酸铵水溶液，梯度洗脱：0~20min 乙腈从5%增加到45%，20~25min 乙为为45%。流速：0.8mL·min；柱温：40℃；检测波长：230nm；进样量：10uL。在上述色谱条件下，9种化学药品可以完全分开，以阿司匹林峰计理论板数不低于5000。 2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系 精密配制各系列对照品溶液，在上述色谱条件下进样分析。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表1. 表1 9种化学药品的线性关系 化学药品 线性范围 (gmL) 线性方程 阿司匹林 30~600 Y=1.74×104X-7.59×102 0.9996 对乙酰氨基酚 30~600 Y=4.00×104X+9.55×102 ( 0.9996 头孢氨苄 25~~500 Y=1.51×104X+5.40×102 0.9995 磺胺甲噁唑 80~1600 Y=2.71×104X+4.17×102C 0.9997 甲氧苄啶 16~320 Y=6.83×104X-2.77×102 0.9998 氨基比林 15~300 Y=2.73×104X-5.12×102 0.9997 芬布芬 30~600 Y=1.23×104X-5.55×10 0.9996 双氯芬酸钠 2.5~50 Y=3.78×104X+3.52×10² ec0.9998 布洛芬 20~400 Y=1.92×104X-6.82×10 0.9999 2.3.2 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6次(阿司匹林对照品稀释成 0.12mg·mL'单独进样)，各化学药品峰面积的 RSD为0.4%~1.3%，色谱峰保留时间的 RSD为0.03%~0.08%。 2.3.3 检出限和定量限 以信噪比(S/N) 为3作为检出限(LOD)，信噪比为10作为定量限(LOQ)，9种化学药品的检出限和定量限测定结果见表2。 表2 9种化学药品的检出限和定量限 ng 化学药品 LOD LOQ 化学药品 LOD LOQ 阿司匹林 3.5 11.5 氨基比林 0.3 1.0 对乙酰氨基酚 0.6 2.0 芬布芬 3.2 10.5 头孢氨苄 0.8 2.6 双氯芬酸钠 0.4 1.2 磺胺甲噁唑 8.8 30 布洛芬 2.3 7.6 甲氧苄啶 1.3 4.2 2.3.4 回收率试验 取一次剂量的制剂粉末(或溶液)，精密加人9种对照品贮备液各25mL，照供试品溶液的制备方法操作，平行制备6份供试品溶液，与对照品随行进样分析样品，按外标一点法计算，测定9种化学药品的回收率，结果见表3。从结果可以看出，9种对照品的回收率及 RSD 值均符合要求。 表3 9种化学药品的回收率(n=6) % 化学药品 回收率 RSD 2 3 4 5 6平均值 阿匹林 99.297.595.594.298.597.4 97.1 1.9 对乙酰氨基酚 99.198.497.299.398.5101 98.9 1.3 头孢氨苄 98.3 96.595.198.499.198.597.7 1.6 磺胺甲噁唑 100.2101.499.3101.2 99.8102.4100.7 1.2 甲氧苄啶 97.2 98.5 98.8 99.399.4100.599.0 1.2 氨基比林 102.4100.3100.499.499.7 99.0100.2 1.2 芬布芬 102.1101.298.9100.4101.299.4100.5 1.2 双氯芬酸钠 100.298.4 99.8102.9101.3101.7100.7 1.6 布洛芬 98.2 99.7102.3101.4100.399.6100.3 1.5 3 结果与分析 混合对照品溶液的色谱图见图1，某颗粒剂供试品溶液色谱图见图2。 通过对比对照品和供试品色谱图的保留时间，发现在检测的20种(批)中成药中，只有某颗粒剂中可能添加了对乙酰氨基酚。将检测波长变为240nm重新进样，在两波长条件下测得的对照品和样品峰面积比值相同；用HPLC-DAD检测，对照品溶液中的对乙酰氨基酚与某颗粒剂供试品溶液 中的添加物质的 DAD光谱一致，证明这批中成药中添加了对乙酰氨基酚，见图3。 o.o .55.50.o7.5：10.012.515.017.520.0 22.5 t/min1.阿司匹林；2.对乙酰氨基酚；3.头孢氨苄； 4.磺胺甲噁唑；5.甲氧苄啶；6.氨基比林；7.芬布芬；8.双氯芬酸钠；9.布洛芬。 图1混合对照品溶液 HPLC色谱图 图3 二极管阵列紫外光谱图 为了进一步确认某颗粒剂中添加有对乙酰氨基酚，又采用了液-质联用[液相色谱条件： Agilent1200夜相色谱仪， SepaxHP Ci柱 (4.6mm ×50mm， 3um)，流动相为A：乙腈；B：水(0.1%甲酸)，梯度洗脱， 1.5min 内A从5%增加到95%，流速2mL·min；质谱条件： Agilent 6110质谱仪，电喷雾离子源，正离子检测方式，雾化气压力25psi，干燥气流速10L·min，干燥气温度350℃，采用一级全扫描方式和选择离子监测]进行测定，对乙酰氨基酚对照品溶液的一级全扫描质谱图见图4， 其中 m/z152 为[M+H]+峰，m/z153 为 M+2峰， m/z110 为其热裂解碎片离子峰；对照品溶液和供试品溶液的选择离子监测色谱图见图5和6，二者均在1.1min 出现色谱峰。对供试品溶液中相应位置的峰进行一级全扫描，得到的质谱图见图7，与对照品溶液的一级全扫描质谱图相同，说明供试品溶液中确实含有对乙酰氨基酚。 图4 对乙酰氨基酚对照品的全扫描质谱图 图5 Z乙酰氨基酚的选择离子监测色谱图(m/z 152) 图6 某颗粒剂的选择离子监测色谱图(m/z152) 图7 某颗粒剂的全扫描质谱图 4 讨论 4.1 化学药品的选择 本文选择的9种化学药品包括6种非甾体类抗炎药(阿司匹林、对乙酰氨基酚、氨基比林、芬布芬、双氯芬酸钠、布洛芬)、1种头孢类抗生素(头孢氨苄)和一种磺胺类药物(磺胺甲噁唑)及其增效剂(甲氧苄啶)，它们都与清热解毒类中成药作用相似、且价格便宜、容易被不法厂商非法添加到该类中成药中。本文将9种化学药品用同一方法检测，能够使此类中成药中掺伪的检出更快速、方便。 4. 2 色谱条件的选择 本文分别对等度洗脱和梯度洗脱方式进行了比较。2种方式均能使化学药品达到完全分离，但后者具有分析时间短、柱效高、灵敏度高的优点。 本文考察了柱温对分离的影响，发现在柱温小于40℃时对照品8和9不能完全分开，故最终将柱温定为40℃。 本文在220~280nm 波长范围内对检测波长进行了选择。为兼顾含量较低的药物(双氯芬酸钠和布洛芬)的检测灵敏度和基线平稳，本文选择了230nm作为检测波长。 4.3 混合对照品溶液的稳定性 由于阿司匹林在混合对照品溶液中不稳定，应该先配制各对照品贮备液，临用时再混合进样。若要定量，则阿司匹林对照品要单独进样，以保证测定的准确性。 结论 本文建立了梯度洗脱 HPLC 法同时检测清热解毒类中成药中非法添加的9种化学药品。方法简单、重复性好。本文检测了20种(批)具有清热解毒功效的中成药，发现一次剂量的某颗粒剂中非法添加有 45mg对乙酰氨基酚。由于化学药品添加的量一般都很大，因此掺伪的色谱峰容易识别。使用本文的方法，可以使中成药中掺伪的检出更简单、更系统。 ( 参考文献： ) ( [1] 董永成，杜士明，陈永顺，等.中成药及保健品非法添加化 学成分的类型、危害及对策 [J].时珍国医国药，2006，17 (8)：1601-1602. ) ( [2] 吴春敏，陈海滨.中成药中非法添加化学物质的现状与对策[J].海峡药学，2003， 15 (6)：107-108. ) ( [3] 高华敏，李秀明.中成药中非法添加化学药物有关问题原因 分析与对策[J].淮海医药，2007，25(2)：165-166. ) ( [4 吴泽君，张国浩，王爱良.糖尿乐胶囊中格列本脲的测定 [J]. 中国药事，20 0 4， 18 (12)：7 5 8-759. ) ( [5 张启明，尹华，黄海伟，等.检查中药中非法掺人枸橼酸西地那非的方法研究 [J].药物分析杂志，2002，22(4)：315-16. ) ( 6 张平，黄赵刚，程钢，等.降糖宁胶囊中掺有西药降糖成分 的检测 [J] . 药物分析，2006，10(3)：184-185. ) ( [7 张穗，莫菲.抗风湿类及降血糖中成药中掺自添加西药的检测 [J].中成药，2006，28(2)：30 0 -302. ) ( [8] 姚羽，李慧义，张启明，等.检测镇静安神类中成药中非法添加化学药品的方法研究 [J].中国药学杂志，2007，42 (3)： 2 24-225. ) ( 9 中国药典[S].二部，2005：60，95-96，117-118，1 7 0， 225-226， 8 57-857. ) ( 107 胡景莲，吕浩然，于黎明. .中药制剂中添加对乙酰氨基酚 的检测方法探讨 [J].中国临床医医研究杂志，2004， 113： 1 1882-11883. ) ( [117 国家食品药品监督管理局.中药生产验证指南 [M].北 京：中国医药科技出版社，2003. ) ( 127 药品管理法[S]. 中华人民共和国主席令第45号，2001. ) ( [131 国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药药知[M].北京： 化 学工业出版社，2005. ) ( [14] 孙小翠，高尚，刘艳丽，等.检查清脑降压片中非法添加 氢氯噻塞的方法 [J]. 中 国药事，2007，21(7)：504- 506. ) 网址： www.yuweichina.com Email： watercom HPLC法同时检测清热解毒类中成药中非法添加的9种化学药品目的建立同时检测清热解毒类中成药中非法添加的9种化学药品(阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢氨苄、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氨基比林、芬布芬、双氯芬酸钠、布洛芬)的高效液相色谱法。方法采用RESTEK C18色谱柱,流动相为乙腈-0.05mol.L-1乙酸铵溶液,梯度洗脱;流速0.8mL.min-1;检测波长230nm;柱温:40℃。结果9种对照品在较宽的浓度范围内,峰面积和浓度有良好的线性关系(r≥0.9995)。检出限为0.3~8.8ng,定量限为1.0~30ng。结论该法简单,重复性好,可同时检测中成药中是否非法添加有上述9种化学成分。