熟肉制品中诱惑红检测方案(固相萃取仪)

表3 HPLC梯度洗脱程序 Preekem 全自动固相萃取-液相色谱法检测熟肉制品中3种合成色素 编号：ANIET1402 摘要：本方法参考《GB/T 5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定》标准，结合实际情况优化实验条件，用乙醇/氨水/水(89：1：10)溶液提取肉制品中的合成色素，取离心后的溶液浓缩后用20%柠檬酸调pH至酸性，应用 EXTRA 全自动固相萃取仪，使用聚酰胺柱分离、净化，淋洗液经浓缩、转换溶剂定容后，供 HPLC-DAD检测，外标法定量分析。 关键词：合成色素，苋菜红，胭脂红，诱惑红， EXTRA， HPLC 引言： 食品的颜色是食品感观质量的重要指标之一，好的食品色泽更受消费者欢迎，且具有更大的商业价值。在现代食品加工中，合成色素的使用十分普遍。目前食用合成色素基本上都是焦油色素，焦油色素是以苯、甲苯、萘等煤焦油成分为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等有机反应合成，-与天然色素相比，焦油色素性质稳定、色彩鲜艳、牢固度大、易于着色，并可任意调色，成本低廉、使用方便，因而被广泛应用。我国《食品添加剂使用标准》中对允许使用的合成色素种类、使用范围和限量进行了详细的规定。但作为一类使用广泛的食品添加剂，部分食品生产中可能存在食品添加剂超范围或超量使用情况。食用这种食品可能对人体产生危害，可能引发癌症；另外还可能存在同一种食品中同时添加多种食品添加剂的情况。这些添加剂的不合理使用直接危害着人们的身体健康，可见加强对食品中合成色素的检测，控制食品质量具有非常重要的意义。 到2006年为止，我国批准使用的合成色素有21种，其中最常用的有胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄和亮蓝等，均为水溶性色素。使用范围限于饮料、配制酒、糖果、糕点和青梅等，禁止用于肉类、鱼类、水果及其制品(红肠肠衣除外)。然后肉禽食品中却常检测出食用合成色素。目前国家标准方法 GB/T5009.35-2003 中食品中人工着色剂用聚酰胺吸附法，制成水溶液，注入高效液相色谱仪测定其含量。然而对于熟肉制品，丙酮/水(9：1)提取效率较差，回收率较低。 本文在优化提取溶剂后，选用EXTRA全自动固相萃取仪，免人工干预，i，自动完成SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤，释放了大量实验室劳力。收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换定容后，!以高效液相色谱仪 (HPLC-DAD)完成了肉制品中胭脂红、苋菜红、诱惑红三种色素含量的测定。 OH 诱惑红 1.试剂、仪器及器材 1.1试剂 甲醇(AR)：经0.5um滤膜过滤。 丙酮/水(9：1)：量取90mL丙酮， 10mL水，混匀。 甲醇/甲酸(6：4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL， 混匀。 乙醇/氨水/水(89：1：10)溶液：量取无水乙醇89mL，氨水 1mL， 水10mL， 混匀。 20%柠檬酸溶液：称取 20g柠檬酸(C6HgO7·H20)，加水至100mL，溶解混匀。 乙醇/氨水/水(7：2：1)：量取无水乙醇70mL，氨水20mL， 水10mL，混匀。 乙酸胺溶液 (0.02mol/L)：称取 1.54g乙酸铵，加水至1000mL， 溶解，经0.45um滤膜过滤。 1.2仪器及器材 全自动固相萃取仪 EXTRA(上海屹尧)、安捷伦1100高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、超声波清洗仪、电子天平、超纯水机、高速离心机、氮吹仪、移液枪、C18色谱柱(4.6X250mm，5um)、聚酰胺小柱 (500mg/3mL) 2.实验方法 2.1提取 称取2g(精确到 0.01g)经绞碎的样品于50mL离心管中，加入20mL 乙醇/氨水/水 (89：1：10)溶液，超声提取 10min， 6000r/min 离心3min，收集上清液，再向残渣中加入10mL 提取液，重复提取直至提取液无明显颜色，合并上清液。将上清液在80℃下氮吹至2.5mL左右，再用20%柠檬酸溶液调 pH 值到6。 2.2净化 5mL水活化→上样上→6mL甲醇/甲酸(6：4)淋洗 8mL水林洗—(9mL乙醇/氨水/水(7：2：1)洗脱 2.3分析 洗脱液在80℃下氮吹至干，用水定容至2mL， 经0.45um 滤膜过滤后用 HPLC 分析。 2.4仪器条件 2.4.1 EXTRA净化程序 EXTRA 净化程序如表1所示： 表1 EXTRA净化程序 动作 位置 溶剂 体积(mL) 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 水 6 120 120 活化 水 5 20 2 上样 样品溶液 5 20 2 清洗 外针 水 6 120 120 稀释 水 5 20 15 上样 样品溶液 5 20 2 空气 1 60 60 甲醇/甲酸(6：4) 6 20 2 淋洗 水 8 20 2 空气 8 60 60 洗脱 乙醇/氨水/水(7：2：1) 5 20 2 2.4.2色谱条件 进样量：10uL；柱温：35℃；流速：1.0mL/min，检测波长范围及梯度洗脱程序分别如表2、表3所示： 表2DAD 检测波长范围 时间(min) 设定值(nm) 参考值(nm) 0 450 800 2.3 560 800 3.5 516 800 4.7 620 800 5.4 530 800 6.8 560 800 时间(min) 甲醇% 0.02mol/L 乙酸铵溶液% 0 10 90 3 65 35 6 98 2 2.5标准曲线 移取一定量的三种色素标准储备液配置如表4所示浓度混合系列溶液，进行高效液相色谱分析，以峰面积与标准系列溶液浓度进行线性回归。 表4标准曲线浓度表 苋菜红 胭脂红 诱惑红 储备液浓度(mg/mL) 1.03 0.367 1.016 1(mg/mL) 0.00412 0.004404 0.004064 2(mg/mL) 0.00824 0.008808 0.008128 3(mg/mL) 0.0206 0.02202 0.02032 4(mg/mL) 0.0412 0.04404 0.04064 3.结果与讨论 3.1样品前处理方法的优化 GB/T 5009.35-2003 标准中并没有提及熟肉样品的处理方法，通常用丙酮/水(9：1)溶液进行提取，但是实验过程中发现用此种提取液提取多次后，熟肉制品中仍有明显颜色，而且回收率较低，因而本文对提取溶剂进行了优化，选用乙醇/氨水/水 (89：1：10)溶液作为提取溶液。提取效果对比图如下图所示： 图1乙醇/氨水/水(89：1：10)提取后熟肉颜色图(其中左边第一个为空白样品，其余三个为加标样品) 图2丙酮/水(9：1)提取后熟肉颜色图(其中左边第一个为空白样品，其余三个为加标样品) 由图中可以看出，乙醇/氨水/水(89：1：10)提取后加标样品颜色与空白样品颜色基本一致，而丙酮/水(9：1)提取后的加标样品中仍带由明显颜色。 3.2色谱图 通过高效液相色谱分离，利用 DAD 检测器检测，在2.4.2色谱条件下，标准溶液、加标样品和空白样品的色谱图如下所示： 图3空白样品、样品加标、混标色谱图 由图中可以看出，三种人工合成色素保留时间重现性良好，样品经净化后无明显干扰。 3.3标准曲线回归方程 将混合标准系列溶液在2.4.2色谱条件下进样分析，以混合系列标准溶液浓度为横坐标(Area)，以相应峰面积为纵坐标(Amt)进行线性回归。回归方程及相关系数如下表所示： 表4标准曲线回归方程及相关系数 组分 回归方程 相关系数 苋菜红 Area=15144.308*Amt-6.3914357 0.99998 胭脂红 Area=28034.2083*Amt-10.335109 0.99995 诱惑红 Area=30468.3253*Amt-5.5785242 0.99995 3.4加标回收率、相对标准偏差 在2.0g空样样品中添加适量三种色素的标准混合液，平行三份，进行加标回收实验。加标回收率、相对标准偏差如下表所示： 表5回收率及精密度实验结果 组分 本底值 加标值 平均测定值 RSD (n=3) 平均回收率 (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) 苋菜红 0 0.0103 0.00707 5.49% 68.6% 胭脂红 0 0.01101 0.00849 2.14% 77.1% 诱惑红 0 0.01016 0.00859 4.13% 84.5% 3.5讨论 3.5.1本方法适用于大批量样品的同时检测，样品量大，所以本实验采用了 EXTRA 全自动固相萃取仪进行净化处理，免人工干预，自动完成SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤。全自动固相萃取仪采用正压技术控制液体流速，保证液体传送的准确性和重现性，从而避免了重复的人工操作及人为误差，并且能够确保良好的重现性和精确性，便于方法的实验室间转移，也便于建立行业乃至国家的实验室标准。 3.5.2本实验中所选取的熟肉样品中所含油脂较少，所以前处理中未进行去油脂处理，对于含油脂较多的熟肉样品，提取前可利用相似相溶原理，用石油醚去除油脂后再进行提取。 3.5.3由于赤藓红对酸不稳定，而此方法中净化步骤中用到甲醇/甲酸(6：4)进行淋洗除杂，所以此方法不适宜于对样品中赤藓红进行分析。 3.5.4净化前调pH至酸性时，所选用的酸不能对聚酰胺柱子产生影响。本文做过实验比对，用甲酸和20%柠檬酸调 pH 后进行净化时发现，用甲酸调pH至酸性的样品上样时色素在小柱上扩散很严重，上样还未完成时已经扩散至柱子底端，并且用甲醇/甲酸(6：4)进行淋洗除杂时，会有少量色素被洗出。而用20%柠檬酸调节 pH 至酸性的样品上样时未发生扩散，仍在柱子顶端。 4.结论 本实验采用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱法同时检测熟肉制品中的三种人工合成色素：苋菜红、胭脂红、诱惑红。该方法抗干扰性强，具在、有较高的灵敏度，回收率符合要求，精密度 RSD 值也都较小。因此本方法能同时检测熟肉制品中3种合成色素，对市售熟肉制品起起很好的筛查作用。 ( 参考文献 ) ( [1] GB/T 5009.35-2003《食品中着色剂的测定》 )