乳制品及特殊膳食中阿莫西林检测方案(液相色谱柱)

乳制品中双氯青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V残留量检测方法 ——LC-MS/MS法 牛奶中的抗生素残留会使人被动地接受，并积累抗生素，对抗生素产生耐药性，患者用抗生素治疗时，效果下降。有些“过敏”体质的人，长期饮用甚至会造成“休克”。经常饮用抗生素残留超标的牛乳会破坏人体的肠道菌群平衡。牛乳中残留抗生素还会对人体产生直接或间接毒性。 因为抗生素的影响，酸奶、奶酪等一些高质量牛奶产品无法加工生产，造成很多原料奶的浪费，致使企业经济受到很大损失。 根据国家有相关规定和卫生规范，1990年在乳与乳制品管理办法第四条明确规定：乳牛在应用抗生素期间和停药后5天内的牛乳不得食用。近期，又多次规定在婴儿配方奶粉、学生奶及绿色食品中不得含有抗生素。2001年9月农业部发布的《无公害食品生鲜牛乳》行业标准中明确规定“抗生素不得检出”。 2试剂与材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。 2.1甲醇，色谱纯 2.2 乙腈， 色谱纯 2.3磷酸二氢钠(NaH，PO) 2.4氢氧化钠 2.5磷酸盐缓冲液：称取20g NaH，PO溶容 1L水中，用10mol/L NaOH调节pH=8.5±0.1 2.6固相萃取柱：Waters OasisTM HLB (300mg/6mL) 3.1液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾 (ESI) 源 3.2匀浆机 3.3高速冷冻离心机 3.4氮吹仪 3.5固相萃取器 4测定步骤 4.1提取 称取试样10 g(±0.01g)于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入20 mL 乙腈均质2 min， 10000 rpm离心10 min， 上清液转移至100 mL梨形瓶中；再向残渣中加入20 mL 乙重重复操作一次，合并两次上清液于100 mL 梨形瓶中。提取液在40℃水浴中减压浓缩除去乙腈有机相。 4.2净化 向上述浓缩液中加入5 mL 的磷酸缓冲液(1.5)稀释溶解，全部转移到 HLB 柱上(HLB预先依次用5mL甲醇，5mL 水， 5 mL磷酸缓冲液活化)。上样液全部通过后，用2mL水淋洗抽干，最后用5 mL乙腈洗脱并接收至10 mL离心管中，40℃条件下氮气吹干溶剂，用1mL乙腈/0.1%甲酸水溶液(2/8)溶解定容，上清液经0.45 om 微孔滤膜过滤，HPLC-MS/MS测定。 4.3仪器测定 液相色谱： Agilent 1200 LC 色谱柱： Agilent SB-C18， 2.1 ×150，3.5 om 进样体积： 10 ot 流量： 0.3 mL/min 柱温： 30℃ 流动相： A-0.3%Acetic Acid： B-100%ACN+0.3% Acetic Acid 表1.梯度洗脱时间表 时间 A B 流量(ml/min) 0 90 10 0.3 2 90 10 0.3 2.01 35 65 0.3 8.0 35 65 0.3 8.01 5 95 0.3 表2.质谱多反应检测表 时间 化合物 母离子 子离子 Dwell (ms) Fragmentor(V) 碰撞能(V) 0 amoxicillin 366 114 100 110 15 208 100 110 5 ampicillin 350 160 100 100 5 192 100 110 10 6. dicloxacillin 470 311 70 110 10 160 70 110 10 Yiyannai penicillin 415 256 70 110 15 199 70 110 10 oxacillin 402 243 70 110 10 160 70 110 10 Penicillin V 351 192 70 100 5 160 70 100 10 Penicillin G 335 176 70 100 10 160 70 100 5 5结果和讨论 5.1方法优化 经过对不同 Fragmentor 电压、不同碰撞能量MRM的比较，我们选定了以上条件(见表2)。 10 ppb 和 50 ppb的回收率表如下： 化合物 回收率(%)(10ppb) 回收率(%)(50ppb) amoxicillin 96.8 110 ampicillin 58 70.6 Penicillin G 75.2 86 Penicillin V 125.4 122.8 Oxacillin 140 137 Yiyannai Penicillin 105 91.3 dicloxacillin 141 141.6 在 0.1-50 ppb 范围内，其线性良好。因为样品含量较低，均采用1/y平方权重。 5.3灵敏度 在0.1ppb时，提取离子色谱图及信噪比： 化合物 信噪比 amoxicillin 366-114 224 ampicillin 350-160 61.6 dicloxacillin 470-160 48.5 Yiyannai penicillin 415-199 52.6 oxacillin 402-160 70.9 Penicillin V 351-160 225.9 Penicillin G 335-160 33.2