牛奶中氨基糖苷类检测方案(液质联用仪)

使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE、Agilent Poroshell 120 和液相色谱/串联质谱分析牛奶中的氨基糖苷类 应用简报 食品检测和农业 作者： 摘要 Andy Zhai安捷伦科技公司 (上海)有限公司 本文开发并验证了一种可同时测定牛奶中壮观霉素、潮霉素B、链霉素、双氢链霉素、阿米卡星、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素氨基糖苷类残留物的方法。首先采用 Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取 (SPE) 方法提取和净化分析物，然后使用液相色谱与电喷雾电离串联质谱 (LC/Tandem MS) 在正离子多反应监测模式下对分析物进行定量。本方法对牛奶中的所有氨基糖苷类残留物均具有 ng/g级检测限。这些化合物的动态校准范围在10到500 ng/g 之间。总体回收率在67%到107%的范围内，相对标准偏差值在1.7%到10.1%之间。 前言 氨基糖苷类 (AG) 是一类广谱抗生素，对一些好氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌活性。AG 已在畜牧业中被广泛应用于治疗细菌感染或促进生长。由于它们具有毒性并且可能造成抗生素抗性，因此它们存在的对人的潜在健康风险受到了极大关注。欧盟 (EU)、中国、美国、日本和其他国家已经针对多种动物源食物中的AG严格规定了其最大残留水平[1，2]。 这项工作的目标在于开发多残留分析方法，用于简单、快速的常规法规分析牛奶中的氨基糖苷类残留物。本方法通过使用聚合吸附剂 (Bond Elut Plexa) 依靠简单的 SPE 步骤完成。表1显示了氨基糖苷类的详细信息。 表1.本研究中所用的氨基糖苷类化合物 化合物 CAS号 LogP 壮观霉素 1695-77-8 -2.3 卡那霉素 59-01-8 -6.3 OH HO- NH OH HN NH. 妥布霉素 32986-56-4I --5.8 双氢链霉素 128-46-1 NA 庆大霉素 1403-66-3 NA 新霉素 1404-04-2 -7.8 试剂与化学品 所有试剂均为质谱、HPLC或分析纯级。乙腈和水购自 HoneywellInternational， Inc.。标准品从 Dr. Ehrenstorfer (德国奥格斯堡)处购得。牛奶购自当地超市。标样溶液(1.0mg/mL)单独在水中制备，储存在冷冻箱(4°C)内。混合工作溶液(10 pg/mL) 在乙：水(10：90)中制备，也储存在4℃条件下。实验时用水对混合工作溶液进行适当稀释，制得浓度较小的加标溶液。 样品制备 称取5g牛奶放入聚丙烯离心管内。向管中加入10ml儿取液(5%三氯乙酸， 0.6mmol/L Na，EDTA 和15mmol/LKH，PO )。充分振摇混合物5 min， 然后在4℃条件下以 4000 rpm 的转速离心5 min。接着将上清液转移到另一个管内。使用5mL提取液重复进行相同的萃取步骤，将上清液混入同一个管内。向萃取物中加入5 mL 0.2 mol/L 的七氟丁酸 (HFBA) 水溶液。将上清液涡旋混合1 min 并在 4000 rpm转速下离心5 min， 然后用 5 mol/L NaOH溶液将其pH调为4.0±0.5。然后准备好样品提取提进行 SPE 步骤。 固相萃取 图1显示了 SPE 步骤。使用3mL乙腈对 Bond Elut Plexa 萃取柱进行预处理，然后用3mL水和 5 mL 20 mmol/L 的 HFBA水溶液进行平衡。然后将样品提取液加载到萃取柱上，样品提取液在重力作用下穿过萃取柱(速度大约为1 mL/min)。用5mL水淋洗萃取柱。对萃取柱施加5 min 全真空以使树脂完全干燥。 用3mL ACN：0.2 mol/L HFBA水溶液在1 mL/min 的流速下洗脱化合物。洗脱液在40℃条件下于氮气环境中干燥。残留物重新溶解于1mL20mmol/L的 HFBA水溶液中。然后对样品进行涡旋混合和超声以充分溶解残留物，并用 0.22 pm 膜对其进行过滤。然后将样品最终转移至2 mL 的色谱样品瓶中准备分析。 平衡液A： 3mL水 平衡液 B： 5 mL 20 mmol/L 的 HFBA水溶液 上样：样品提取液 淋洗：5mL水 干萃取柱真空处理5 min 洗脱： 3mL洗脱液* 在氮气流下于40°℃蒸干 *洗脱液： ACN：0.2 mol/L HFBA (8：2) 水溶液 图1.牛奶净化和富集——Agilent Bond Elut Plexa SPE 步骤 条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 SB-C18， 2.1 × 100 mm， 2.7 pm(部件号685775-902) 质谱条件 在正离子模式下对 AG 进行监测。表2列出了多反应监测的详细信息。 质谱离子源参数 载气温度： 350°C 载气流速： 5L/min 雾化器： 45 psi 鞘气温度：400°C 鞘气流速： 11L/min 喷嘴电压： 正，0V 毛细管： 正， 3500V 表2.多反应监测所得到的质量数 化合物 回归方程 R2 (ng/g) 壮观霉素 Y=13790.2955x+39429.2957 0.996 0.1 15 潮霉素B Y=891.7225x-1190.5976 0.998 0.2 18 链霉素 Y=1197.4506x-2934.9645 0.994 2 25 双氢链霉素 Y=2240.1902x-1236.0908 0.998 0.2 20 阿米卡星 Y=1393.7561x-1742.7928 0.999 0.2 30 卡那霉素 Y=1107.6982x-1720.5534 0.998 0.2 35 安普霉素 Y=288.9123x-207.5481 0.999 0.5 30 妥布霉素 Y=804.6063x-1295.9858 0.999 0.2 40 庆大霉素 Y=1494.7223x-894.2355 0.999 0.2 30 新霉素 Y=183.7889x-240.7272 0.994 0.5 15 卡那霉素 485.3 163.1 150 20 324.2 150 10 安普霉素 540.3 217.1 140 25 378.2 140 12 妥布霉素 468.3 163.2 125 20 324.2 125 庆大霉素 478.3 322.3 125 8 157.2 125 15 新霉素 615.3 161.1 175 30 293.1 175 20 结果与讨论 线性和检测限 在至空白基质中加标混合工作溶液，制得所需溶液 (0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、 0.05 mg/kg、0.1 mg/kg 和0.5mg/kg)， 用于创建外标校准曲线。可通过去除整个步骤(包括预处理和 SPE 步骤)中的牛奶来得到空白基质。将每种化合物信噪比 (S/N) 高于3：1时的浓度作为检测限(LOD)。校准曲线和 LOD的结果列在表3中。 表3.牛奶中氨基糖苷类的线性和检测限 回收率和重现性 在3种浓度水平下测定方法的回收率和重现性：牛奶加标浓度为0.01 mg/kg、0.02 mg/kg 和0.05 mg/kg。每个浓度下重复分析六次。表4列出了回收率和重现性数据。图2给出了加标牛奶萃取物 (0.02 mg/kg) 的色谱图。 表4.牛奶中氨基糖苷类的回收率和重现性 ×103 图2.0.02 mg/kg 加标牛奶样品萃取物的色谱图1.壮观霉素； 2.潮霉素B；3.链霉素；4.双氢链霉素；5.阿米卡星； 6.卡那霉素；7.安普霉素；8.妥布霉素；9.庆大霉素； 10.新霉素 结论 LC/MS/MS 是一种可靠而强大的技术，可同时定量和鉴定牛奶中的氨基糖苷类。本应用简报的结果显示 Agilent Bond ElutPlexa 是一种适合纯化和富集复杂基质(例如牛奶)中多种氨基糖苷类的有效方法。根据基质加标标样得到的回收率和重现性结果表明，本方法符合国际法规对牛奶中氨基糖苷类残留物进行测定的要求。杂质和基质的影响甚微，且没有干扰任何目标化合物的定量。定量限显著低于 MRL [3]. ( 参考文献 ) ( 1.W. Zhu， J. Yang， W.Wei， Y.L， S. Zhang. J. ChromatographyA，1207，29 (2008). ) ( 2. A. Kaufmann， P . Butcher， K. Maden. Anal. C him. Acta， 711 ， 46(2012). ) ( 3. Anon.GB/T 21323-2007 De t ermination of aminoglycosides residues in animal tissu e s-HPLC-MS/MS method. China Standard. General A dministration of Quality Supervision，Inspection and Q uarantine， Beijing， China. ) 如需更多信息 这些数据仅代表典型结果。有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn. www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2013 ( 中国印制 ) 2013年1月18日 5991-1758CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies     摘要    本文开发并验证了一种可同时测定牛奶中壮观霉素、潮霉素B、链霉素、双氢链霉素、阿米卡星、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素氨基糖苷类残留物的方法。首先采用Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取(SPE) 方法提取和净化分析物，然后使用液相色谱与电喷雾电离串联质谱(LC/Tandem MS) 在正离子多反应监测模式下对分析物进行定量。本方法对牛奶中的所有氨基糖苷类残留物均具有ng/g 级检测限。这些化合物的动态校准范围在10 到500 ng/g 之间。总体回收率在67% 到107% 的范围内，相对标准偏差值在1.7% 到10.1% 之间。    前言    氨基糖苷类(AG) 是一类广谱抗生素，对一些好氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌活性。AG 已在畜牧业中被广泛应用于治疗细菌感染或促进生长。由于它们具有毒性并且可能造成抗生素抗性，因此它们存在的对人的潜在健康风险受到了极大关注。欧盟(EU)、中国、美国、日本和其他国家已经针对多种动物源食物中的AG 严格规定了其最大残留水平[1, 2]。    这项工作的目标在于开发多残留分析方法，用于简单、快速的常规法规分析牛奶中的氨基糖苷类残留物。本方法通过使用聚合吸附剂(Bond Elut Plexa) 依靠简单的SPE 步骤完成。表1 显示了氨基糖苷类的详细信息。   结论    LC/MS/MS 是一种可靠而强大的技术，可同时定量和鉴定牛奶中的氨基糖苷类。本应用简报的结果显示Agilent Bond ElutPlexa 是一种适合纯化和富集复杂基质（例如牛奶）中多种氨基糖苷类的有效方法。根据基质加标标样得到的回收率和重现性结果表明，本方法符合国际法规对牛奶中氨基糖苷类残留物进行测定的要求。杂质和基质的影响甚微，且没有干扰任何目标化合物的定量。定量限显著低于MRL [3]。