干酪中质构检测方案(质构仪)

维普资讯 http：//www.cqvip.com中国乳品工业dairyINDUSTRYwww.chinadairy.netrpgy@chinajournal.net.cn 维普资讯 http：//www.cqvip.com研究报告 Research Papers Ca²*和pH值对凝乳酶活性及干酪凝块质构的影响 王墙，罗欣，房广建 (山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018) 摘 要：通过Forlin-酚法测定不同Ca²浓度对凝乳酶活性的影响，探讨钙离子对凝乳酶活性影响机理；在标准加热温度和不同pH值条件下，测定经不同浓度的氯化钙处理后的凝块在不同凝乳时间下质构的差异；以确定干酪生产中氯化钙的合理用量。结果表明：CaCl，添加量为0.02 g/L时凝块的平均切割力最大，此时质构最好。 关键词：钙离子；pH值；凝乳酶；酶活性；质构 中图分类类：Q814 文献标识码：A 文章编号：1001-2230(2006)05-0015-04 Effect of Calcium and pH on chymosin activity and curd WANG Qiang， LUO Xin， FANG Guang-jian (College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China) Abstract： By Forlin-phenol method， the effect of different Calcium concentration on the Chymosin activity was studied and the mechanismof chymosin clotting milk was discussed. Under the condition of standarded heating temperature and dissimilar pH ，the differential TPA dealedwith different Calcium concentration in different clotting time was found out. Finally the suitable amount of added calcium was confirmed. Key words： Calcium ion；pH value ；chymosin； enzyme activity； TPA )引 言 在干酪加工中，常用的酶是凝乳酶和胰蛋白酶。凝乳酶有皱胃酶、胃蛋白酶等，其中最常用的是皱胃酶(EC3.4.23.4)，它是一种内肽酶，其结构与专一性都与胃蛋白酶相似，属于天冬氨酸蛋白酶(aspartic pro-teases)，含有323~340个氨基酸残基，相对分子量为35ku，主要存在于幼小动物哺乳动物的胃液中。在乳蛋白体系中，皱胃酶的作用机理是首先断裂k-酪蛋白的敏感键Phe05—Met，o将键，将酪蛋白表面的疏水巨肽切断，使原先互相排斥的蛋白胶粒结合在一起聚集而沉淀下来。凝乳酶在干酪凝乳过程中起着重要作用，因而成为当今干酪生产研究中的热点之一。 酸性蛋白酶的水解活性依赖于pH值和离子强度，凝乳酶作用于k-酪蛋白的最适pH值为5.0~5.5，在乳中应在pH值6.0，在天然乳pH值为6.7时，凝乳酶仍保持活力。专一性离子Ca*影响凝乳酶的反应速度，Ca*的添 ( 收稿日期：2005-08-22 ) ( 基金项目：国家“十五"奶类重大科技专项资助项目(2002BA518A16-04) ) ( 作者简介：王婧(1979-)，女，硕士研究生，从事乳品科学方面的研究。 ) ( 通讯作者：罗欣 ) 加会加速凝乳的过程。在干酪生产中，加人适量的钙盐，可以缩短凝乳时间，提高干酪的硬度和弹性。本研究将Ca²浓度和pH值作为研究影响凝乳酶活性的主要对象。 本研究通过在不同pH值酶缓冲液中加入不同浓度的钙离子，研究其对凝乳酶凝乳活力的影响，进而探讨钙离子对凝乳酶活性影响机理；同时测定经不同钙离子浓度处理后的凝块在不同凝乳时间下质构的差异，以定Cheddar生酪生产中氯化钙的最适用量，满足干酪生产的需要。 1 材料与方法 1.1 材料与设备 1.1.1 实验材料 鲜奶；凝乳酶(Chymosin)；发酵剂 (L.Lactis sub.Cremoris 和L.Lactis sub.Lactis)；酪蛋白(C-5890 Ca-sein)；酪氨酸(L-Tyrosine)；钨酸钠(NazWO·2HzO)化学纯；钼酸钠 (NaMoO·2HO)分析纯；硫酸锂(LiSO·HO)分析纯。 1.1.2仪器与设备 紫外扫描分光光度计(2450PC)；Texture AnalyserTA.XT2质构仪；Mettler Toledo 电子分子天平；80-2B 型台式离心机；DK-S28型电热恒温水浴锅。 1.2 实验方法 1.2.1 不同浓度Ca²处理后凝乳酶活性的测定定： (1)制备不同浓度酪氨酸的标准曲线。取6支试管，按表1规定的体积，加入蒸馏水与酪氨酸，即得不同浓度得酪氨酸溶液。从不同浓度的酪氨酸溶液中，各吸出1mL，移人另外的6支试管中，再向此6支试管中分别加入1mL酪蛋白溶液，摇匀后置于40℃水浴中，20 min后，各加入质量浓度为100 g/L的三氯乙酸溶液3 mL，混合摇匀，离心除去沉淀。取上清1 mL，分别加入5mL浓度为0.5 mol/L的NazCO，1mL福林-酚试剂，于40℃水浴中谷色20 min，再在680 nm波长处测吸光度。以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。 表1 试验方案 管号 酪氨酸标准液/mL 水/mL 混合液质量浓度/(mgL') 0 10 0 2 9 20 3 2 8 40 3 7 60 5 4 6 80 6 5 5 100 图1 酷氨酸标准曲线 (2)样品测定。本研究所用的凝乳酶为小牛皱胃酶(EC3.4.23.4)是一种胃来源的天氨氨酸蛋白酶，取2g凝乳酶(活力单位为30000，精确到0.0001g)分别用不同pH值的缓冲溶液100 mL配成质量浓度为20 g/L的酶液，然后分别吸取10 mL加到另外的9个容量瓶中，分别用不同浓度的CaCl，处理配成质量浓度为2 g/L的酶液，取4支试管，各加入1mL酶液，取1支作为空白，加入2 mL质量浓度为100 g/L的三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1mL酪素，摇匀后置于40℃水浴中保温20 min。取出试管，3支测试管中各加人2 mL三氯乙酸，空白管中加入1 mL酪素，静置10 min，过虑沉淀，各取上清1 mL，加5mL浓度为0.4 mol/L的NazCOs，1mL福林-酚试剂，于40℃水浴中显色20 min，再用分光光度计于680 nm波长处测吸光度。从标准曲线上查出于此 吸光度对应的酪氨酸的微克数(A)。结果计算 酶的活力单位=A/50×F 式中：A为酪氨酸微克数；F为酶液稀释倍数。本研究中氯化钙质量浓度梯度分别为： 0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0 g/L。 1.2.2 干酪凝乳质构的测定定： 分别取一定量生鲜乳(新鲜无抗牛乳)比重为1.030，方肪为3.5%，蛋白质为2.9%，酪蛋白为2.17%(均为质量分数)。经过72℃、16s杀菌后冷却到31℃，接种3%的发酵剂发酵当pH值达到5.5时(对照组不添加发酵剂，自然pH值为6.0)，添加不同浓度的CaCl，然后添加5/100 000量的凝乳酶，立即分装到杯中并于31℃恒温水浴中保温，分别在10，20，30，40 min时测定样品的物性，每组测3个平行。 质构测定采用Return to start下压法。其参数为 测试模式：力/压力；预压速度为5.00 mm/s；速度为1.00 mm/s；下压距离为10.00 mm； PPS为 200.0；探针为P/45c。 2 结果与讨论 2.1 凝乳酶酶活力的测定 图2 不同钙离子浓度及pH值下的吸光度 由图2可看出，pH值为5.0时，CaCl，质量浓度为0.2g/L时吸光度最大为0.378，此后吸光度随着CaCl质量浓度继续增大时呈减少趋势，当pH值为6.0时虽然凝乳酶的吸光度也遵循先增加后减小的规律但明显的比pH值为5.0和5.5时的小，而且当CaCl，添加量为0.7 g/L时几乎没有吸光度。主要原因是酸性蛋白酶的水解活性依赖于pH值和离子强度，凝乳酶作用于k-酪蛋白的最适pH值为5.0~5.5，当Ca²浓度相同时， pH值为5.0时的离子强度相对于pH值为5.5以及pH值为6.0时的离子强度大，所以对于凝乳酶的活力的影响更大。可见当CaCl，添加质量浓度为0.2g/L时凝乳酶的活性发挥最好。 对于相同pH值下的凝乳酶活性而言，离子强度也就是Ca的质量浓度对酶活影响起决定作用。因为 酶和底物均带负电荷而互相排斥，通过增加离子强度可减弱它们之间的排斥作用，但离子强度增加太多，也会导致其对酶活力非常重要的专一性电荷相互作用，引起酶活性下降，故酶活力随离子强度的增加会出现最大值而后下降4。因此能最大程度的激活凝乳酶活性的CaCl质量浓度为0.2 g/L以及pH值为5.0，这与图3~6中分析得出的凝块质构测定结构相一致。 CaCl质量浓度对凝乳酶活性产生影响还与凝乳酶作用于底物(酪蛋白)时底物结构相关联。干酪加工应用的酸性蛋白酶对酪蛋白的Phe105-10键呈高度专一性，这种专一性源于敏感键(即底物一级结构)的氨基酸序列、-酪蛋白的构象(二、三级结构)和凝聚的状态，而底物的一级结构及构象受pH值及离子强度影响，所以CaCl，质量浓度以及pH值除了在微观上对凝乳酶活性产生影响的同时也会在宏观上影响凝乳酶凝乳能力和速度。 专一性离子Ca²影响凝乳酶的反反速度，Ca²的添加会加速凝乳的过程。在干酪生产中，加入适量的钙盐，可以缩短凝乳时间，提高干酪的硬度和弹性除了凝乳酶影响干酪凝集速度外，胶体磷酸钙的状态也是一个重要的影响因素。它和pH值的变化关系密切，凝集速度随pH值的下降而上升；此现象的一种解释是pH值下降钙离子活性增加，故凝集速度增加。另一种观点认为是pH值对胶体磷酸钙的影响向起的。胶体磷酸钙的解离可以导致胶体凝集速率的下降，pH值的下降会引起磷酸钙的溶解，但在乳中增加了Ca²浓度，一正一负的两种效益抵消，使凝集表现较小的pH值依赖性。 2.2 干酪凝乳质构的测定 图3为凝乳10 min时氯化钙质量浓度对凝块平均力的影响。 图3 凝乳10 min时氯化钙浓度对凝块平均力的影响 由图3可看出，保温10 min添加发酵剂的凝块(pH值为5.0)在CaCl质量浓度为0.2g/L时，质构的切割平均力达到了12.2g，在pH值为5.0的条件下凝块的平均力随着添加CaCl，量的增加而增加达到0.2 g/L后迅 速减小，当CaCl，添加量达到0.7 g/L时平均力最小为2.4g；而在pH值为6.0的条件下，平均力随CaCl，量的增加呈不规则变化，CaCl，质量浓度达到0.4 g/L前平均力先增加，当质量浓度达到0.2 g/L后逐渐减小，CaCl质量浓度在0.2 g/L时平均力最大为5.9 g，质量浓度达到0.4 g/L后又呈增加趋势；当质量浓度达到0.7 g/L时平均力最大为6.0 g，超过了CaCl，质量浓度为0.2 g/L时的平均力。这是因为CaCl，添加到乳中自身也会影响牛乳的承受力，故当CaCl质量浓度达到0.7 g/L时平均力要比0.2 g/L时大。 图4为凝乳20 min时氯化钙质量浓度对凝块平均力的影响。 图4 凝乳20 min时氯化钙质量浓度对凝块平均力的影响 由图4可看出，保温20 min时添加发酵剂的凝块(pH值为5.0)当CaCl，质量浓度为0.2 g/L时平均力最大为11.1 g；随着CaCl添加量的增加，平均力呈先增加后迅速下降趋势，不添加发酵剂的凝的(pH值为6.0)平均力变化趋势与图3相同，在CaCl质量浓度达到0.4 g/L前平均力当CaCl质量浓度为0.2 g/L时最大为5.9g，达到0.4g/L后平均力随着CaCl，添加量的增加而增加，当质量浓度达到0.7g/L时最大为6.2g，原因与图3中的解释相同。 图5为凝乳30 min时氯化钙质量浓度对平均力的影响。 图5 为凝乳30 min时氯化钙质量浓度对平均力的影响 由图5可看出，保温30 min，pH值为5.0的条件下，CaCl质量浓度为0.2 g/L时凝块的平均力最大为11.9 g，当质量浓度达到0.2 g/L后平均力随着CaCl，添加量的增加而迅速减少；pH值为6.0的条件下平均力的变化趋势同图3和图4；CaCl质量浓度在达到0.4 g/L之前，CaCl，质量浓度为0.2 g/L时凝块的平均力最大为4.9 g，其他质量浓度下的平均力的变化并不显著，这说明CaCl质量浓度达到0.4 g/L后，pH值为6.0，和CaCl质量浓度达到0.2 g/L，pH值为6.0凝乳30 min时凝乳的质构已基本达到稳定状态，凝块平均力的变化只是CaCl，离子强度变化的表现，凝块质构本身已稳定，质构的变化不是因为CaCl添加量的不同。这与图4的分析结构相同。图6为凝乳40 min时氯化钙质量浓度对平均力的影响。 图6 凝乳40 min时氯化钙质量浓度对平均力的影响 由图6可看出，保温40 min，pH值为5.0的条件下CaCl质量浓度为0.2g/L时凝块的平均力最大为12.9g，而后平均力随着CaCl添加量的增加而迅速减少；pH直为6.0的条件下平均力的变化趋势同图3~5；CaCl质量浓度达太0.4 g/L之前当CaCl质量浓度为0.2 g/L时凝块的平均力最大为5.7 g，而后平均力变化不大；这这明pH值为6.0凝乳40 min时的凝块质构早已形成，基本不受CaCl，添加量的影响，与图5分析的结果相一致。 综合图3~6的结果可以得出，pH值为5.0，CaCl，添加量为0.2g/L，保温40 min时凝块的平均切割力最大为12.9 g；而pH值为6.0时， CaCl，添加量为0.2g/L，保温20 min时凝块的平均力较大为5.9g，但是随着保温时间的延长，CaCl质量浓度大于0.2 g/L时平均力呈增加趋势。分析原因可能是：专一性离子Ca²影响酶反应的速度，Ca²的添加会加速凝乳过程，主要是其对反应的凝聚阶段产生影响，也有报道Ca²影响酶反应的速度，但Ca²浓度≥8 mmol/L，则酶活力下降(Bringe和Kin-sella，1986)。 3 结 论 通过测定经不同CaCl质量浓度处理后的凝乳酶的活性得出，在CaCl，添加量为0.2g/L时凝乳酶的活力最大，这与经过同样条件处理的凝块的质构测定结果相符合，说明了在干酪生产中添加适量的钙离子确实能加速凝乳的时间及凝块的质量；特别是对于硬质干酪而言能改善产品的最终质构，对于添加CaCl，及调节pH值的相互作用能否对最终产品的蛋白降解以及风味产生影响，有待于进一步进行研究。 ( 参考文献： ) ( [1] ROBERTA B.Factors affecting the clotting properties of sheep milk[]. 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