血液透析患者中氧化应激和炎症水平检测方案(纯水器)

2007；27(9)南方医科大学学报(J South Med Univ)·1435 维普资讯 http：//www.cqvip.com·1436·南方医科大学学报(J South Med Univ)第27卷 超纯水对维持性血液透析患者氧化应激和炎症水平的影响 张长莹，刘俊，陶惠琴，刘志强，田建伟(南方医科大学南方医院肾内科，广东广州510515) 摘要：目的研究超纯水对维持性血液透析患者氧化应激和炎症水平的影响。方法对36例符合条件的患者采用重复测量自身对照的方法，测定在使用超纯水前、后6个月及12个月时血清晚期氧化蛋白产物(AOPP)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、髓过氧化物酶(MPO)、白蛋白(Alb)、C-反应蛋白(CRP)、新喋呤、肿瘤坏死因子 α(TNF-a)、白细胞介素6(IL-6)水平。结果改进水处理系统后，透析用水的细菌和内毒素含量明显下降(P<0.01)。随访一年中，各项页测指标在不同时间点的差异均有统计学意义(P<0.05)；6个月时血清 AOPP、MDA、GSH-Px、Alb、CRP、新喋呤、TNF-水平较使用超纯水前明显改善(P<0.05)，且 MPO 有非常显著的差异(P<0.01)；12个月时 IL-6(P<0.05)、MDA(P<0.01)水平进一步下降。相关分析显示血清 MPO 活性与 AOPP 及 CRP水平在改用超纯水前后均呈正相关关系。结论改用超纯水后患者的氧化应激和炎症水平显著降低，且MPO 也许可以同时提示氧化应激和炎症水平。 关键词：超纯水；血液透析；氧化应激；炎症 中图分类号：R692.5 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2007)09-1435-03 Effects of ultrapure water on the levels of oxidative stress and inflammation parameters inmaintenance hemodialysis patients ZHANG Ying， LIU Jun， TAO Hui-qin， LIU Zhi-qiang， TIAN Jian-wei Department of Nephrology， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China Abstract： Objective To evaluate the effects of ultrapure water on the levels of oxidative stress and inflammation parametersin maintenance hemodialysis patients. M卜ethods Thirty-six stable maintenance hemodialysis patients were involved in thisstudy， who were free of acute infection， vasculitis or disease activity and on hemodialysis therapy for at least 3 months beforeusing ultrapure water. The parameters including serum advanced oxidation protein products (AOPP)， malondialdehyde(MDA)， glutathione peroxidase (GSH-Px)， myeloperoxidase (MPO)， albumin (Alb)， C-reactive protein (CRP)， neopterin ，tumor necrosis factor (TNF)-a， and interleukin (IL)-6 were measured before and 6， 12 months after use of ultrapure water，respectively. Results After modification of the water management system， the microbial counts and endotoxin concentrationdecreased significantly (P<0.01). During the study period， the levels of the measured parameters gradually improved， showingsignificant difference between the time points of measurement (P<0.05)： Use ofultrapure water for 6 months significantlyimproved serum AOPP， MDA， GSH-Px， MPO， Alb， CRP， neopterin， and TNF-a levels (P<0.05)， and the level of IL-6 wasfurther reduced after 12 months (P<0.05). Serum MPO activity was closely correlated with AOPP (r-0.335， P<0.05) and CRP(r=0.369 or 0.347， P<0.05) before or after use of ultrapure water. Conclusions Ultrapure water can improve the status ofoxidative stress and inflammation in maintenance hemodialysis patients. Serum MPO activity may help estimate the levels ofoxidative stress and inflammation. Key words： ultrapure water； hemodialysis； oxidative stress； inflammation 许多研究报道长期血液透析患者的透析相关病因(dialysis-related pathology， DRP)是增加终末期肾病患者死亡率及患病率的最常见原因之一。由透析诱导的氧化应激和慢性微炎症状态可加速 DRP的进展。透析系统的生物不相容性特别是有微生物污染及热源成分的透析液与氧化应激和慢性微炎症的反应密切相关。 污染的透析液促进了活性氧簇的生成，加速了氧 ( 收稿日期：2007-01-20 ) ( 作者简介：张莹(1981-)，女，在读硕士研究生，E-mail： zhangying303@126.com ) ( 通讯作者；刘俊，教授， 硕 士生导师，电话：020-61641598，E-mail：Liujun62@fimmu.com ) 化应激，表现为丙二醛(MDA)等脂质过氧化产物和晚期氧化蛋白产物(AOPP)、髓过氧化物酶(MPO)等氧化物质的增高，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase， GSH-Px)等抗氧化物水平的降低。透析液中的细菌衍生物可刺激单核巨噬细胞合成和释放促炎症因子，如：白细胞介素1、肿瘤坏死因子 α(TNF-a)、白细胞介素6(IL-6)，它们是长期血液透析治疗中急性或慢性炎症疾病的关键介质。其中，IL-6可促进肝脏产生急性期蛋白(C-反应蛋白(CRP)、血浆淀粉A)并减少血浆白蛋白(Alb)的合成。为了提高透析液纯度，超纯水的使用是一个基础先决条件件3。本研究旨在观察和探讨透析用水改善前后对维持性血液透析患者氧化应激及炎症水平的影响情况。 1材料与方法 1.1研究对象 选取在本院血液透析中心进行维持性血液透析治疗的患者，排除急性感染、血管炎及其它活动性疾病，病情稳定，透析龄≥3月。符合条件并完成改用超纯水后12个月的跟踪随访试验的患者有36例(男性24例，女性12例)，平均年龄为 56.25±11.85(30~75)岁，透析龄中位数为 19.50(3~192)月，其中原发性肾小球肾炎8例，肾移植后慢性排斥8例，糖尿病肾病5例，高血压肾病5例，梗阻性肾病3例，多囊肾1例，其余病因6例。 1.2血液透析 采用 Aquaboss EcoRⅡ水处理装置，透析用水循环管路采用无死腔环路系统。在保持其他治疗不变的前提下改用超纯水进行血液透析12个月，每周2~3次，每次4h，应用普通肝素或低分子肝素抗凝。 1.3标本采集 于透析前采静脉血，30 min 内低温离心(2000r/min，5 min，4℃)分离血清，置-70℃保存，尽早完成检测。 1.4细菌及内毒素监测 用无菌注射器在透析机机口处抽取透析用水2ml，每次取样3例，置于细菌培养管及无致热源瓶内，前者立即进行细菌培养，后者在酒精灯下封口，-70℃保存待检内毒素。采用动态浊度法进行内毒素定量检测，动态内毒素定量测定仪由天津大学无线电厂生产，型号 BET-32B，动态浊度法试剂由湛江安度斯生物有限公司生产，可测内毒素范围：0.02~10.0EU/m1。 1.5氧化指标检测 AOPP测定按文献[4]的方法进行；MDA检测采用硫代巴比妥酸反应法I5]，GSH-Px活性检测采用5'，5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸(购自 Sigma公司，USA)比色法[6]，MPO活性测定采用比色法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 1.6炎症指标检测 血清新喋呤 (neopterin) 水平采用竞争性ELISA 法测定，使用德国IBL公司试剂盒；血清TNF-a和 IL-6含量采用 ELISA 法测定，使用深圳晶美公司进口分装试剂盒；血盒 CRP 和 Alb 水平由我院检验科常规测定。 1.7统计学处理 数据以均数+标准差表示；重复测量数据采用重复测量方差分析，组间多重比较用 LSD 检验；若Mauchly 球形检验结果 P≤0.05，则对自由度进行Greenhouse-GeisserEE矫正。两参数间的相关关系选 择 Pearson 相关系数表示(若非双变量正态分布，则选择 Spearman 相关系数)。全部数据采用 SPSS11.5统计软件进行分析处理。 2结果 2.1透析用水的细菌及内毒素水平 水处理系统改进前透析用水细菌培养菌落数为(85.05±13.35)CFU/m1，改进后6个月、12个月时均无细菌生长(P<0.01)。内毒素水平在改进前、改进后6个月、12个月时分别为 0.30 EU/m1、<0.02 EU/m1、<0.02EU/ml(P<0.01)。 2.2患者氧化应激水平的变化 改用超纯水后，患者氧化应激的各项指标均有不同程度的变化(表1)：AOPP、MDA、GSH-Px、MPO 水平在3个时间点之间有显著性差异(P<0.05)。与使用超纯水前相比，6个月时AOPP、MDA、GSH-Px水平均明显改善(P<0.05)，且 MPO 活性有非常显著差异(P<0.01)；12个月时 MDA 水平进一步下降(P<0.01)。 2.3患者炎症水平的变化 改用超纯水后，患者炎症的各项指标均有不同程度的改变(表1)：血清 CRP、新喋呤、TNF-c、IL-6、Alb含量在不同时间点之间差异有统计学意义(P<0.05)。与使用超纯水前相比，6个月时 CRP、新喋呤、TNF-α明显降低(P<0.05)，Alb 水平明显升高(P<0.05)；12个月时各项指标有进一步改善的趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。 表1试验中氧化应激和炎症水平的变化 Tab.1 Changes in oxidative stress and inflammatoryparameters during the study period (Mean±SD) Before UPW UPW Switch to UPW 6 months 12 months P AOPP (umol/L) 85.69±17.28 81.10±16.28* 81.02±17.80* *0.034 MDA(pmol/L) 4.45±0.82 4.02±0.75* 3.99±0.72** 0.006 GSP-Hx (U/L) 152.56±24.73 163.23±26.22*164.69±32.42 0.049 MPO (U/L) 51.23±11.88 44.87±7.44** 45.17±6.35**( 0.001 Alb (g/L) 36.38±2.59 37.86±3.43* 38.01±3.23** ( 0.003 CRP (mg/L) 9.59±6.18 7.78±5.29* 7.34±6.39* 0.044 Neopterin (nmol/L) 153.65±54.88 140.58±43.76* 137.24±37.86*I 0.044 TNF-一(pg/ml) 9.69±4.12 8.13±4.39* 7.78±4.61* 0.036 IL-6(pg/ml) 13.80±4.88 12.16±3.69 11.58±3.98* 0.033 *P<0.05 us baseline (before using UPW)； **P<0.01 us baseline. UPW：Ultrapure water； AOPP： Advanced oxidation protein products； MDA：Malondialdehyde； GSP-Hx： Glutathione peroxidase； MPO：Myeloperoxidase； Alb： Albumin； CRP： C-reactive protein； TNF-o： Tumor necrosis factor-a； IL-6： Interleukin-6 2.4氧化应激水平与炎症水平的关系 在试验的3个时间点中，AOPP、CRP与其余指标的相关关系(表2、3)比较可见：更换超纯水后，多 数氧化应激指标之间、氧化应激与炎症指标之间、炎症指标之间的P值有逐渐增高的趋势，相关关系减弱或消失。 表2试验中 AOPP与其余指标的相关关系 Tab.2 Correlation between AOPP and otherparameters in these patients (r(P)) AOPP MDA GSP-Hx MPO Alb Neopterin TNF-a IL-6 CRP UPW0m -0.13 -0.204 0.335 -0.128 0.375 0.355 0.222 0.286 r(P) (0.938) (0.233) (0.046)))(0.475) (0.024) (0.033) (((0.193) (0.133) UPW6m -0.204 0.153 0.175 0.093 0.184 0.422 -0，003 0.255 r(P) (0.233) (0.372) (0.307) (0.589) (0.283) (0.010) (0.985) (0.134) UPW 12m -0.267 0.022 0.335 -0.129 -0.094 0.244 0.145 0.5 r(P) (0.116) (0.9) (0.046) (0.455) (0.584) (0.152) (0.399) (0.002) 表3试验中CRP与其余指标的相关关系 Tab.3 Correlation between CRP and otherparameters in these patients (r (P)) CRP AOPP MDA GSP-Hx MPO Alb Neopterin TNF-o IL-6 UPW0m 0.286 -0.203 0.158 0.369 -0.509 0.316 0.260 0.213 r(P) (0.133)) (0.236)(0.356) (0.027))((0.002) (0.061) (0.126) (0.211) UPW6m 0.255 0.02 0.144 0.288 -0.151 0.227 0.043 0.396 r(P) (0.134) (0.909) (0.403) (0.088) (0.379) (0.183) (0.803) (0.017) UPW 12 m 0.5 -0.007 -0.09 0.347 -0.049 0.114 0.136 0.351 r(P) (0.002) (0.969) (0.603) (0.038) (0.776) (0.508) (0.428) (0.036) 下降，故取这两个时间点分别做各指标的相关分析。其中，AOPP水平与MPO 活性均密切相关。说明由于水质改善，活性氧生成减少以及中性粒细胞呼吸爆发产生的 MPO活性降低，引起转化生成次氯酸减少，导致 AOPP 水平下降。另外，血清 MDA 水平持续降低，GSH-Px活性逐渐升高，说明脂质过氧化程度降低，抗氧化的能力有所改善。 循环中的新喋呤主要由单核细胞产生，故其被认为是单核细胞活化的重要指标。TNF-c、IL-6主要由单核巨噬细胞释放，是明确的致热源；CRP 是炎症介质刺激肝细胞产生的急性相蛋白，是尿毒症患者的慢性炎症标志110]，对透析患者死亡具有预示作用"1。试验中，血清新喋呤、TNF-α、IL-6、CRP含量明显降低，说明超纯水中污染物质的减少可在透析过程减少单核细胞的活化，降低促炎症介质的释放，并能持续降低炎症状态。相关分析示 CRP水平与 MPO 活性呈正相关，进一步表明 MPO 参与了氧化应激和炎症反应，它可能是同时提示氧化应激和炎症水平的新指标。 试验中AOPP、CRP 与其余指标的 改用超纯水前，血清 AOPP与MPO、新呤、TNF-a水平呈正相关(r值分别为0.335、0.375、0.355，P<0.05)，CRP 与. MPO 水平呈正相关(r-0.369，P<0.05)，与Alb 呈负相关(r=-0.509， P<0.05)；使用超纯水后1年再行相关分析，血清AOPP 与 MPO、CRP水平呈正相关(r值分别为0.335、0.500，P<0.05)，CRP 与MPO、IL-6水平呈正相关(r值分别为 0.347、0.351，P<0.05)，其余指标未得出相关关系。 3 讨论 本试验证明当透析用水细菌和内毒素含量明显下降时，氧化应激及炎症的各项检测指标在6个月时能明显改善，并且这种状态在1年内能维持或进一步改善。 AOPP是蛋白质被单核细胞、中性粒细胞活化生成的次氯酸所修饰的产物，是反映氧化应激的敏感指标和慢性肾功能衰竭患者的炎症介质[4]。MPO是体内将氯化物转化为次氯酸的独一无二的作用酶，因此，它被认为是尿毒症患者体内连接急性期炎症和氧化应激的桥梁。也有学者认为 MPO是反映膜生物相容性的指标。改用超纯水1年内，AOPP 及 MPO水平均明显降低，MPO下降程度更显著。由于改用超纯水前氧化应激水平最高，改用后的一年水平已稳步 相关关系提示：使用超纯水前，维持性血液透析患者的炎症水平较高，并且炎症是产生氧化应激的主要原因，因此氧化应激水平与炎症水平密切相关；当透析用水改善后，患者的炎症状态明显好转，氧化应激水平不是主要由炎症引起，而可能是与血液透析引起抗氧化剂的丢失或透析膜的生物不相容性有关关。 低蛋白血症对维持性血液透析患者心血管疾病的发生具有强烈的预示作用。Alb 被认为是一种迟发负性炎症蛋白[12]，且是常用的营养学指标。试验中，随着超纯水使用的时间延长，Alb 水平显著性升高，说明超纯水能逐渐改善 Alb 水平的重要原因可能与炎症状态的改善有关。 综上所述，超纯水的使用能显著改善维持性血液透析患者体内氧化应激及炎症状态，并间接的改善营养水平，减少透析相关淀粉样变及营养不良-炎症-动脉粥样硬化综合征等并发症，从而提高患者的生存质量，改善患者的预后。 ( 参考文献： ) ( [1] Canaud B， Cr i stol JP， Morena M， et al. Im b alance of oxidants andantioxidants i n haemodialysis p a tients [J]. 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