大蒜多糖中单糖组成和含量检测方案(离子色谱仪)

Oct.2014 Vol. 21 No.10·74·Chinese Journal of Information on TCM 2014年10月第21卷第10期中国中医药信息杂志·75· 离子色谱法测定大蒜多糖的单糖组成和含量 柏冬'，韩春霞，王瑞海海，刁作彬1，刘丽梅' 1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京100700；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，北京100007 摘要：目的 建立测定大蒜多糖的单糖组成和含量的离子色谱法。方法 以氨基酸分离柱，氢氧化钠/醋酸钠溶液梯度洗脱，脉冲积分安培检测器(Au 为工作电极，Ag/AgCl为参比电极)检测，测定大蒜多糖水解产生的单糖组成及含量。结果 大蒜多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄萄、木糖、果糖等单糖组成，各单糖基本达到分离，线性关系良好，相关系数均>0.998，平均回收率均在95%~105%之间。结论 所建立的方法准确、简单，可用于大蒜多糖中单糖的含量测定和质量控制。 关键词：离子色谱法；大蒜多糖；单糖；半乳糖；葡萄糖；甘露醇；果糖 DOI： 10.3969/j. issn. 1005-5304.2014.10.022 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)10-0074-03 Determination of Composition and Content of Monoses in Garlic Polysaccharide by IonChromatographyBAI Dong， HAN Chun-xia， WANG Rui-hai， DIAO Zuo-bin， LIU Li-mei' (1.Institute ofBasic Theory， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China； 2.Thermo Fisher Scientific，Beijing 100007， China) Abstract： Objective To establish a method to analyze the composition and content of monosesin the garlic polysaccharide by ion chromatography. Methods The monoses in the solution ofgarlic polysaccharide hydrolysised by trifluoroacetic acid were determined by amino PAC column，eluted by gradient hydroxide sodium and identified by ampere detector (AU as working electrode，.Ag/AgCl as reference electrode). Results The garlic polysaccharide was mainly composed byarabinose，galactose， glucose， xylose and fructose. Good resolution could be achieved among theabove mentioned five kinds of monoses.B.Their linear correlations over the investigatedconcentration were above 0.998， while the average recovery rates were in the range of 95%-105%Conclusion The ion chromatography method is fast， accurate， simple and reliable， and can beapplied in the content determination and quality control of garlic polysaccharide. Key words： ion chromatography； garlic polysaccharide； monose； galactose； glucose； xylose；fructose 大蒜多糖具有增强免疫、抗氧化、治疗高脂血症、防护紫外线损伤4、润肠通便、心肌保护[6]抗炎保肝等作用，兼具药用和保健作用，有很高的开发价值。目前主要利用比色法测定植物中多糖181，本课题组前期已建立了利用比色法测定大蒜多糖含量的方法。但该方法专属性较差，样品中其他类成分可能会造成干扰。 多糖是由单糖通过糖苷键结合而成，准确测定多糖的单糖组成以及各单糖的含量，对于多糖的质量控制具有一定意义。离子色谱法与比色法相比，不仅对 ( 基金项目：国家科技重大专项-新药创制平台中药新药探索性 课题(2009ZX09301-005-11) ) ( 通讯作者：刘丽梅 ， E-mail： liulimeihrb@sina. com ) 组成多糖的单糖可以直接分离并进行含量测定，而且灵敏度高、重现性好。已有文献报道利用离子色谱法测定大蒜多糖中的单糖组成和含量[11-12]。本研究对该方法进一步优化，采用离子色谱法建立大蒜多糖的质量控制方法。 仪器与试药 ICS 3000 离子色谱仪(戴安公司，美国)，配置脉冲安培检测器(Au 电极，S/N 0050150，糖四电位波形)。 单糖对照品阿拉伯糖(批号111506-200001)、半乳糖(批号100226-201105)、葡萄糖(批号110833-200904)、木糖(批号111508-200404)、果糖(批号111504-200001)均购自中国食品药品检定研究院，大蒜多糖为本实验室自制。 2方法与结果 2.1 对照品溶液的制备 取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖对照品，用蒸馏水溶解，配制成各单糖糖度分别为1.5、1.5、15、1.5、75 mg/mL的单糖储备液。使用时，用蒸馏水按标准曲线使用浓度稀释。 2.2 供试品溶液的制备 取样品15 mg，精密称定，精密加入2 mol/L 三氟乙酸溶液10 mL，匀匀，密闭，80℃水解4h。放至室温后，精密吸取100 pL，加水稀释至20 mL，0.22 um滤膜过滤，即得。 2.3 色谱条件 色谱柱： CarboPac PA20 分析柱(150 mm×3mm，S/N 003654)，CarboPac PA20 保护柱(50 mm×3 mm，S/N 003405)；以氢氧化钠溶液梯度洗脱(0~25 min，2 mmol/L NaOH； 25.1~30 min， 100 mmol/L NaOH，300 mmol/L NaAc； 30.1~40 min， 200 mmol/L Na0H；40.1~50 min， 2 mmol/L NaOH)；流速：0.45 mL/min。 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液5pL，按“2.3”项下色谱条件分析，色谱图见图1。可见，大蒜多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖5种单糖组成，在该色谱条件下均可得到良好分离，基线平稳。 t/min 1.阿拉伯糖；2.半乳糖；3.葡萄糖；4.木糖；5.果糖 图11大蒜多糖中单糖成分离子色谱图 取大蒜多糖 26.9 mg， 加入 2 mol/L 三氟乙酸溶液20 mL 溶解，摇匀，分成5份，每份4mL。以上5份样品均在80℃水浴中水解，分别水解2、3、4、5、6h。按“2.2”项下比例稀释，按“2.3”项下色谱条件进样测定，各供试品中各单糖峰面积见表1。结果显示，阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖在4h达到最大值，木糖、葡萄糖在3h达到最大值。综合考虑，最终选择80℃水解4h作为水解条件。 表1 大蒜多糖样品不同水解时间各单糖峰面积测定结果 水解时间 阿拉伯糖 半乳糖 葡萄糖 木糖 果糖 2h 0.4240 0.199 9 6.5063 0.1708 29.7493 3h 0.4281 0.1986 6.6077 0.2116 29.9377 4 h 0.4334 0.2651 6.7358 0.2054 29.1996 5h 0.4164 0.2690 6.3732 0.197 7 27.9225 6h 0.4090 0.2929 6.3618 0.1764 27.147 3 2.5 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下单糖储备液，用蒸馏水稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件分析。以各单糖浓度(mg/L)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果显示各成分线性关系良好，回归方程和相关系数见表2。 表225种单糖成分线性关系考察结果 成分 回归方程 相关系数 线性性围(mg/L) 阿拉伯糖 Y=0.0033+0.461X 0.9998 0.2~1.5 半乳糖 Y=0.0141+0.536X 0.9983 0.2~1.5 葡萄糖 Y=0.0233+0.3892X 0.9998 2.0~15.0 木糖 Y=0.0183+0.6014X 0.9998 0.2~1.5 果糖 Y=0.2788+0.2033X 0.9992 10.0~75.0 2.6 米精密度试验 精密吸取“2.5”项下单糖对照品溶液(阿拉伯糖、半乳糖、木糖均为0.75 mg/L，葡萄糖7.5 mg/L，果糖37.5 mg/L)，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次。结果阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖的平均峰面积的RSD(n=6)分别为0.31%、0.56%、0.46%、0.31%、0.54%。 2.7 禾稳定性试验 取同一供试品溶液，于制备0、2、4、6、8、10h进样测定，结果阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖的平均峰面积RSD(n=6)分别为1.50%、1.28%、1.31%、3.57%、2.11%。表明供试品溶液中各成分在10h内稳定性基本良好 2.8 重复性试验 精密称取同一大蒜多糖样品6份，按“2.2”项下 方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定含量。结果样品中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖的平均含量(n=6)分别为 0.32%、0.14%、5.14%、0.18%、70.67%， RSD分别为8.3%、15.8%、7.2%、10.7%、3.3%。表明品试品中总糖及含量较高的果糖重复性良好，由于影响样品水解因素较多，对于样品中含量较低的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖其重复性略差。 2.9 加样回收率试验 精密称取“2.8”项下已测知含量的样品6份，每份15mg。精密加入10 mmol/L 三氟乙酸溶液10 mL，摇匀，密闭，80℃水解4h。放至室温，精密量取50 pL，加入单糖对照品溶液 50 uL，用蒸馏水稀释至20mL，0.22 pm滤膜过滤。按“2.3”项下色谱条件进样分析，计算回收率，结果见表3。各单糖平均回收率在95%~105%之间，表明该方法基本可行，但由于影响样品水解因素较多，各单糖回收率 RSD 值均相对较大。 表3大蒜多糖中5种单糖成分加样回收率试验结果(n=6) 成分 样品含量(mg) 加入量(mg) 平均回收率(%) RSD(%) 阿拉伯糖 0.24 0.38 97.25 5.1 半乳糖 0.11 0.19 96.45 7.4 葡萄糖 3.86 3.75 104.95 10.1 木糖 0.14 0.19 98.72 8.6 果糖 53.00 56.25 97.45 5.1 3 讨论 传统单糖的测定方法基本是衍生化后利用气相、液相色谱进行分离、检测。由于需要衍生化，样品处理过程繁琐，测定结果准确性、重复性较差，待测成分易被干扰，而且衍生化试剂一般具有毒性。离子色谱法不需要衍生化即可直接分析几乎所有的单糖和大部分的寡糖及低聚糖10，节省了操作步骤和时间，提高了检测的准确性、重复性，由于不使用衍生化试剂，提高了试验的安全性。 本研究采用离子色谱法测定大蒜水解液中的单糖组成，结果与文献报道的大蒜多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露醇和果糖12组成有所不同，本试验测定结果显示大蒜多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和 果糖组成。其可能原因主要有几点：①文献报道的大蒜多糖提取工艺与本试验不同，得到的大蒜多糖的质量不完全相同；②本试验提高了检测的灵敏度，测定出含量较低的阿拉伯糖；③本试验方法提高了分离能力，将原本不易分开的木糖和甘露糖分离。 通过离子色谱测定大蒜多糖的单糖组成，不仅可以分析多糖的构成，而且准确测定了各单糖的含量，单糖含量之和可以用来衡量对比多糖的质量。与传统比色法测定总多糖相比，消除了非糖类成分的干扰，提高了检测的专属性，结果更加真实，同时为其他多糖的质量控制提供了借鉴。 ( 参考文献： ) ( [1]薛欣，张立石，柏冬，等.大蒜3个有效部位联合应用对人胃癌 MKN45细胞的杀伤作用[J] . 中国实 验 方剂学杂志，2011，17(14)：152 - 155. ) ( [ 2]包永芬，单士刚.大蒜多糖对甲醛所致人胚肝细胞损伤的保护作用[J]. 河北医药，2013，35(1)：16-17. ) ( [ 3]向宏.魔芋大蒜多糖胶囊治疗高脂血症的临床疗效观察[J].医学信息： 中旬刊，2011，25(2)：652-6 5 3. ) ( [ 4 ] 史毓杰，江振友，陈琛，等.大蒜多糖对中波紫外线辐射后 HaCaT 细胞凋 亡的影响[J].中国老年学杂志 ， 2011，31(9)：1590-1591. ) ( [ 5]张民，毕华，纪绪前，等.大蒜多糖提取物组成成分分析及通便功效研 究[J].中国食品添加剂，2012，13(4)：7 5 -79. ) ( [6]余薇，李璐，姚社，等.蒜多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作 用[J] . 中国药理学通报，2010，26(5)：69 7 -699. ) ( [7]姜中毅，程富胜，苏鹏.大蒜多糖对四氯化碳致小鼠肝炎血清及组织转氨酶影响[J].甘肃农业大学学报，2008，50(4)：40-42. ) ( [8 ] 梁存权.比色法测定植物多糖含量方法概述[J].北方药学，2011，8(12)： 4 ，86. ) ( [9 ] 王瑞海，柏冬，刘丽梅.比色法测定大蒜多糖提取物中总多多含量[J] 中国实验方剂学杂志，2012，18(10)：158-161. ) ( [ 10]刘庆生，范志影.离子色谱法检测糖[J].现代科学仪器，2005，22(1)： 75-78. ) ( [11]欧云付，尹平河，赵玲，等.离子色谱法测定大蒜中的糖[J].光谱实验 室，2006，23(3)：6 2 9-632. ) ( [12]李国强，尹平河，赵玲，等.离子色谱-积分脉冲安培检测法测定大蒜多糖的单糖组成[J]. 分 析测试学报，2007，26(3)：401-403，408. ) ( (收稿日期：2013-12-0 4 ；编辑：陈静) ) ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net       多糖是由单糖通过糖苷键结合而成,准确测定多糖的单糖组成以及各单糖的含量,对于多糖的质量控制具有一定意义。离子色谱法与比色法相比,不仅对组成多糖的单糖可以直接分离并进行含量测定[10],而且灵敏度高、重现性好。已有文献报道利用离子色谱法测定大蒜多糖中的单糖组成和含量[11-12]。本研究对该方法进一步优化,采用离子色谱法建立大蒜多糖的质量控制方法。