生物活体中临床诊断检测方案(激光拉曼光谱)

肿瘤细胞的拉曼光谱研究 拉曼光谱及拉曼成像在医学医疗研究中的应用 赛默飞世尔科技(中国)有限公司马书荣 关键词 引言： 疾病诊断，尤其是细胞和组织癌变的早期发现，一直以来都是困扰人们的难题。随着科技进步和医疗技术水平的发展，人们对于早期病变组织的诊断灵敏度和准确性获得了很大提高。但是有些疾病，991例如有胸痛临床表现的急性心肌梗塞等，必须在最短的时间内做出正确的判断，最为常见的诊断手段是心电图。但是约33%的病人其心电图是没有异常的。而其他常规诊断手段如血检，需要长于1h的时间，且必须在专业实验室中进行，远远超出了必须获得诊断结果的时限。在癌变组织中，即使在细胞或组织尚未发生电镜下可见的形态学改变之前，由于细胞增殖、分化或恶变及一些活性因子的分泌等都会引起组织中DNA、RNA、蛋白质和脂类等物质的结构改变，仅仅依赖传统方法，无法实现快速准确的诊断。拉曼光谱技术作为一种分子振动光谱技术，可以很容易的实现对这些物质的检测和鉴别，这在早期诊断中显得尤为重要。相比荧光和红外分析方法，共焦显微拉曼成像光谱技术具有无需样本预处理、无损伤、微区检测、穿透度深、光谱分辨率高、谱带信息丰富、无惧水等优势。 Thermo Scientific DXR系列显微拉曼光谱仪，是完全一体化的高性能研究级拉曼光谱仪，结合高度的自动化，操作简单，提供高灵敏度高空间分辨率的性能。DXR2xi快速成像拉曼光谱仪在硬件及软件上进行了更进一步的革新，结合超快速成像技术，可在短时间内获得超量的化学信息。在病理或毒理检测过程中，与传统的病理学组织切片相比，无需繁琐的样品处理及化学试剂，切片可重复使用，可以实时、无损的对病变组织和细胞进行快速的诊断筛选。对位于某 些特殊解剖部位无法或不宜进行活检时，超快速的DXR2xi显微拉曼成像光谱仪在极短时间内通过信息巨大的拉曼成像及拉曼光谱，还可以实现对活体的无损快速检测。此外，拉曼光谱不仅可以对病变诊断进行定性分析，采用Thermo Scientific专利软件 TQ Analyst还可以对大量样本的微小成分改变进行化学计量学分析，对于判断病变发展及疾病分期具有非常重要的意义。 近年来，越来越多的研究者和使用者采用DXR系列显微拉曼光谱仪探索拉曼光谱技术在临床诊断方面的应用，并取得了相当大的进展。除了较为广泛的蛋白质、核酸、脂类、酶、碳水化合物等简单的物质分子检测与鉴定，还在组织学、病理学、毒理学、血液、肿瘤细胞鉴别、药物代谢等领域取得了很好的研究成果。本文将集中讨论几起已发表的研究成果。 骨修复材料的生物相容性和生物活性的拉曼光谱研究?碳羟基磷灰石/β-葡聚糖复合物在骨修复过程中能够形成磷灰石，可作为一种骨修复材料使用。显微拉曼成像可用于分析复合物在修复过程中的生物相容性和生物活性。图1是在小鼠骨缺损部位植入复合物一个月时，复合物和骨组织边界的拉曼成像及对应拉曼光谱。PO3的振动峰960cm-1随着骨修复生长，强度减弱。在植入复合物一个月时，拉曼成像表明在复合物和脱钙骨组织之间形成了丛状骨组织。复合物、丛状骨组织和脱钙骨组织的拉曼光谱在960cm²1(PO3-)的峰强度依次减弱，在脱钙骨组织区域消失。1069cm1(碳水化合物及磷酸盐)在丛状骨组织区域消失。这些显著的差异性表明骨修复材料在骨修复过程中具有很好的生物相容性。 图1.a)10X拉曼成像， b)白光图像， c)100x拉曼成像， d)对应成像区域的拉曼光谱， e)1，3和6个月的骨修复样品平均拉曼光谱Po3-的峰 (Anna Sroka-Bartnicka， James A. Kimber， Leszek Borkowski， Marta Pawlowska， Izabela Polkowska， Grzegorz Kalisz， AnnaBelcarz， Krzysztof Jozwiak， Grazyna Ginalska and Sergei G. Kazarian. Anal Bioanal Chem， 2015) 伤口愈合过程的拉曼光谱研究 3伤口愈合是胶原、脂类、蛋白质等物质生成的过程，在拉曼光谱中表现出显著的指纹特性。如图2，老鼠伤口不同愈合时期的平均拉曼光谱表现出不同的特征性。图3是结合多元光谱分析方法(多因子得分)实现无损分析愈合伤口及伤口愈合时期的鉴定，图4是采用赛默飞的专利软件TQ Analyst 对样本进行聚类分析，判断伤口愈合时期，快速找到未愈合及愈合缓慢的伤口，对于病情诊断和进一步治疗具有重要的意义。 图3多元因子分析及因子得分光谱的非负最小二乘拟合 图2.不同时期老鼠伤口的平均拉曼光谱 (day0，n= 30)， (day1，n= 36)， (day 5， n=23)和 (day 7， n=23). Factor 1loading_ 图4.伤口愈合时期的聚类分析 (Rishabh Jain， Diego Calderon， Patricia R.Kierski， Michael J. Schurr， Charles J. Czuprynski， Christopher J. Murphy， JonathanF. McAnulty， and Nicholas L. Abbott. Anal. Chem. 2014， 86， 3764-3772.) 药物代谢过程的拉曼光谱研究 4抗癌药物在癌细胞中的代谢过程，也可以采用快速拉曼成像进行评价和分析。6MP在细胞中代谢生成6-巯基嘌呤-核糖(MPR)，两者以不同的方式与核壳结构的Au@Ag纳米粒子结合， 其SERS光谱表现出明显的差异，如图5所示。图6是采用无标记的SERS成像实时监控6MP在一个人体肺腺癌细胞中的新陈代谢。当6MP代谢到10-16h时，大部分6MP转化成为6MPR，到24h时，几乎全部转化成6MPR。 图6.SERS成像监控6MP在一个人体肺腺癌细胞中随时间增长的新陈代谢 图5.6MP和6MPR的SERS光谱 表面增强拉曼技术帮助检测血液肌红蛋白 图7是拉曼表面增强结合光流体用于心脏血液生物标记物肌红蛋白的检测，使用样品实现快速的血液检测，根据某个结构的峰强随浓度的变化规律，实现定量分析。 (Guangmei Han， Renyong Liu， Ming-Yong Han， Changlong Jiang， Jianping Wang， Shuhu Du， ianhua Liu， and Zhongping Zhang. Anal. Chem. 2014，86， 11503-11507) 图7.R6G(a)，肌红蛋白(b)，和牛血清中的R6G标记肌红蛋白(c)的SERS光谱； R6G标记肌红蛋白的白曼光谱中537cm-1(黑)和600cm²1(红)随浓度变化的SERS强度 (Gerard L. Cote， Jun Kameoka， Haley Marks.2014， DOI： 10.1117/12.2065418) 肿瘤细胞的早期发现和识别在医学研究及临床诊断中非常重要。一些研究者采用DXR系列拉曼光谱仪在这一领域获得了一些很好的成果。5图8是通过显微拉曼定位，准确采集6种不同的肿瘤细胞及其周围正常组织的光谱。肿瘤细胞与正常细胞、不同的肿瘤类型之间在拉曼光谱中均表现出较大的差异，通过光谱的差异性，可以实现肿瘤细胞的鉴别与分类。此外，6也可以采用快速拉曼成像技术对某些不确定区域进行快速成像，通过层序聚类分析获得特征区域分布的图像，进行癌变区域的鉴别和诊断(如图9)。 图8.不同类型癌变细胞(灰色)和正常组织(黑色)的平均拉曼光谱：(A)软骨肉瘤，(B)恶性外周神经鞘肿瘤， (C) 肺鳞癌，(D)肺腺癌，(E)横纹肌肉瘤， (F) 肝肿瘤 (Aleksandra Paviceciv， Sofija Glumac， Jelena Sopta， Ana Popovic Bijelic， Milos Mojovic，Goran Bacic. Croat Med J. 2012，53：551-557) Postion(micrometers) 图9.胸腺癌细胞 (BT549细胞)和结肠直肠癌细胞(HCT119细胞)的拉曼成像分析(Vaclav Ranc， Josef Srovnal， Libor Kvitekand Marian Hajduch. 2013，DOI： 10.1039/C3AN00855J) 拉曼光谱在斑马鱼发育过程的活体研究 此外，拉曼成像技术还成功应用在了活体检测，7研究纳米粒子传感器在活体斑马鱼发育中的生物相容性和生物活性，实时监控斑马鱼发育过程中复杂的生理过程(图10)。8采用增强效果更好的SERS基底，采用快速拉曼成像成功实现了对单个细菌的检测(图11)。 图10.斑马鱼(受精后发育14-16h)肌肉组织的拉曼成像(A，可见白光图，是卵黄囊，Ⅲ是血管，Ⅲ是体节；B，1078cm-1特征峰成像分布； a，b，c分别对应I， I及Ⅲ的拉曼光谱) ( Joseph Irudayaraj et al， ACS Nano， 2010， 7(4)，4039-4053) 图11.单个细菌的拉曼成像分析(a) SEM图，((b)可见白光图， (c)拉曼成像， (d)对应成像标记区域的拉曼光谱(Junfeng Wang et al， ACS Appl. Mater. Interfaces 2015， 7， 20919-20929) 在本应用报告中，只是展示了一部分在医学研究、临床诊断研究中的应用，目的在于鼓励和启发将拉曼光谱及拉曼成像技术更加广泛的应用在医学医疗研究领域。 DXR系列显微拉曼光谱仪因其快速、无损、高空间分辨、超快速成像等特点，对于临床诊断和医学研究，不但可以快速实现蛋白质、核酸等物质分子结构到细胞水平的检测和诊断，还可以实现活体检测，信息丰富，数据直观可视。Lo同时，与其他临床诊断与医学研究方法相结合，也提供了一种重要的辅助手段。 ( 1. Gerard L. Cote， Jun Kameoka，Haley M a rks.2014，DOI： 10.1117/12.2065418 ) ( 2. Anna Sroka-Bartnicka， James A. K imber， L eszekBorkowski， M arta Pawlowska， Izabela Polkowska，Grzegorz Kalisz， A nna B e lcarz， Krzysztof Jozwiak，Grazyna Ginalska and Sergei G. Kazarian. Anal Bioanal Chem，2015. ) ( 3. Rishabh Jain， Diego Calderon， Pat r icia R. Ki e rski，Michael J. Schurr， Charles J. C z uprynski， Christo-pher J. Murphy， Jonathan F . McAnulty， and Nicho-las L. Abbott. Anal . Chem. 2014， 8 6， 3764-3772. ) ( 4. Guangmei Han， R enyong Liu， Ming-Yong Han，Changlong Jiang， Jianping Wang， Shuhu Du， ian-hua Liu， and Zhongping Zhang. Anal. Chem. 2014， 86，11503-1 1 507 ) ( 5. Aleksandra Paviceciv， Sofija Glumac ， Jelena Sopta，Ana Popovic Bijelic， Milos Mojovic， Goran Bacic. Croat Med J. 2012， 53：551-557 ) ( 6. Vaclav Ranc， Josef Srovnal， Libor Kvitek and Marian Hajduch.2013，DOI： 10.1039/C3AN00855J ) ( 7. Joseph I rudayaraj et a l ， AC S Nano， 2010，7(4)， 4039-4053 ) ( 8. Junfeng W ang et al， ACS Appl. Mater. Interfaces2015，7，20919-20929 ) ThermoS CIENTIFIC 赛默飞世尔科技热线电话：ales.cad@thermofisher.comwww.thermofisher.comSCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 骨修复材料的生物相容性和生物活性的拉曼光谱研究2碳羟基磷灰石/β-葡聚糖复合物在骨修复过程中能够形成磷灰石，可作为一种骨修复材料使用。显微拉曼成像可用于分析复合物在修复过程中的生物相容性和生物活性。图1是在小鼠骨缺损部位植入复合物一个月时，复合物和骨组织边界的拉曼成像及对应拉曼光谱。PO43-的振动峰960cm-1随着骨修复生长，强度减弱。在植入复合物一个月时，拉曼成像表明在复合物和脱钙骨组织之间形成了丛状骨组织。复合物、丛状骨组织和脱钙骨组织的拉曼光谱在960cm-1（PO43-）的峰强度依次减弱，在脱钙骨组织区域消失。1069cm-1（碳水化合物及磷酸盐）在丛状骨组织区域消失。这些显著的差异性表明骨修复材料在骨修复过程中具有很好的生物相容性。