氨基糖苷类抗生素(HILIC)中主要成分含量检测方案(液相色谱柱)

目录 极性保留策略树(反相、亲水作用色谱) 极性化合物典型应用文集 Waters 极性化合物保留策略 HILIC保留机制 2三聚氰胺 氨基糖苷类抗生素 糖异构体的分离 检测自来水中的丙烯酰胺 百草枯与敌草快 首试条件： T3柱一低pH(pH3)， 高水相(>95%)；T3柱可兼容100%水相， 可筛选pH 2-7。 XBridge° Shield RP18柱一碱性分析物高pH(pH10)，高水相(>95%)；该柱可兼容100%水相， 可筛选pH3~10。 XBridge Amide柱一乙腈：水95：5，中等pH(pH5， 流动相含10mM醋酸铵和0.02%醋酸)；酸性、中性与混合分析物首选该柱，该柱可筛选条件pH3~10. XBridge HILIC柱一乙水：水95：5，中等pH(pH5，流动相含10mM醋酸铵和0.02%醋酸)；碱性分析物首选该柱，该柱可筛选条件pH2~8。 Atlantis/CORTECSHILIC柱一乙腈：水95： 5， 低pH(pH3， 流动相含10mM甲酸铵和0.2%酸酸)；碱性分析物首选该柱。 了解HILIC的工作原理 保留机制 一如色谱学中的所有机制作用，任何一种分离总是受各种溶质之间的相互作用以及这些溶质在流动相和固定相之间的动态平衡所支配。在HILIC中，保留机制是液液液分配、吸附作用、离子相互作用和亲水性保留作用的复杂的多模式组合，从而使HILIC与RPLC相比具有独特的选择性和保留特性[图1]。然而，单一的保留机制并非主导所有分离。分析物的成功保留主要取决于流动相的组成[有机溶剂和pH]、流动相与固定相的相互作用及分析物的化学性质和结构组成。 图1：因HILIC因其多模式保留机制，具有相对于反相色谱的正交性的选择性，在HILIC的色谱条件下，吗啡的葡萄糖苷酸代谢物继吗啡之后被洗脱。 HILIC是正相色谱的变体，其保留强度与溶质极性成正比，而与流动相极性成反比。因所使用的固定相为极性[即：未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子等]，故可轻易吸附水及其它极性溶剂。极性分析物随固定相极性的增加和流动相极性的降低表现出更强的保留。这是基于相似相容的原理。如果固定相比流动相具有更强的亲水性，则极性分析物倾向于与固定相作用，从而增加保留。然后，通过逐渐增加流动相的极性而使分析物依次洗脱[在HILIC中，水是最强的洗脱溶剂]。尽管在流动相中增加极性溶剂的量可促进洗脱过程，然而，该极性溶剂的存在还可使固定相表面吸附上一层极性层，对于建立液立液分配从而获得对极性分析物的保留是必不可少的[图2]。 图2：在固定相表面吸附一层极性溶剂对于保留极性化合物而言是必不可少的。在这里，我们观察到极性碱性化合物[胞嘧啶]在流动相和固定相表面吸附水层之间的液一液分离。 在HILIC中，吸附和分配保留机制相互关联。吸附保留机制只是简单的溶质与流动相之间对于固定相上的极性吸附位点的竞争。而分配保留机制则是由于分析物在流动相和固定相表面的吸附水层上的溶解度差异。为使填料表面形成亲水层，流动相中至少包含3%的极性溶剂，才可使固定相充分的与水结合[溶剂化]。 各填料色谱柱特点 HtlANtisColumns Atlantis° HILIC Silica (pH 1-5)规格： 3 um， 5 pm 及制备 Linker ar CORTECS COLUMNS 规格：1.6 um，2.7 um CORTECS° HILIC Silica (pH 1-5) D- ACQUITY UPLC° BEH Amide XBridge°Amide (pH 2-11) BEH Technology~ NH2 规格：1.7 um，2.5 um， 3.5 pm， 5 pm 及制备 Acquity ACQUITY UPLC° BEH HILIC Bridge XBridge° HILIC (pH 1-9) COLUMNS， 规格：1.7 um，2.5 um， 3.5 um， 5 pm 及制备 色谱条件 色谱柱： HSS T3 4.6x150 mm， 5 um OH 0 OH .OH HO 草酸 0 苹果酸 0 C 波长： UV @ 210 nm 仪器： Alliance° 2695 with 2996 PDA HO O OH 丙酮酸 Z酸 .OH )H H OH .0 HO OH OH 乳酸 酒石酸 OH HO OH 0 HO 马来酸 富马酸 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 甲基咪唑(具体条件参考应用资料：720005200EN) 转化糖(具体条件参考应用资料：国家食品药品监督管理局国家药品标准) 国家食品药品监督管理局国家药品标准 注射用转化糖 Zhu she yong Zhuan hua tang Invert Sugar for Injection 含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。 色谱条件与系统适用性试验：用验胺基三键合亚乙基桥杂化颗粒为填充剂(推荐色谱柱为： Waters XBridge Amide，4.6 mm x150 mm， 3.5 um或效能相当的色谱柱)，以乙腈-水-浓氨溶液(80：20：0.1)为流动相，示差折光检测器，检测器温度和柱温均为40℃。取果糖与无水葡萄糖适量，用乙腈溶液(75一100)制成每1ml中含果糖和无水葡萄糖分别约为5 mg的溶液， 量取20uL，注入液相色谱仪，果糖峰与无水葡萄糖的分离度应符合要求。 二甲双胍(具体条件参考应用资料：720004080ZH) 色谱条件 0.009- 0.006- 0.003- 0.000 -0.003_ 嘉田川 ' 寸N张 -0.003_ 全部条件请参考应用资料720004080EN。 0.0 0.5 1.5 2.0 3.0 4.0 4.5min 阿昔洛韦和鸟嘌呤分析(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64666) 1.Acyclovir (50 pg/ml)2. Guanine (50 pg/mL) 0.08- 006- 仪器： ACQUITY UPLC配置PDA检测器 色谱柱： CORTECS HILIC 1.6 um 2.1x100 mm 分离模式： 等度(流动相A：B 15：85) 流动相A： 0.2%甲酸水 流动相B： 0.2%甲酸乙腈 检测波长： 254 nm 流速： 0.6ml/min 柱温： 30°C 稀释剂： 0.02N NaOH的乙腈/水60：40 核酸类分析(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64663) 小肽分析(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64668) Histidine Dipeptides aR- 0.0- Compounds：1. Creatine， m/z 132 (1 pg/mL)2. Carnosine， m/z 227 (1 pg/mL) 3. Anserine， m/z 241 (5 pg/mL) 有机膦酸(具体条件参考应用资料： ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱应用文集_WA60104) 2| 5. Ethyl methylphosphonic acid (EMPA) 合成氨基酸(具体条件参考应用资料：高效液相色谱法测定门冬氨酸鸟氨酸注射液的含量) 高效液相色谱法测定门冬氨酸鸟氨酸注射液的含量 缪宁梅，马婕 江苏省药品检验所，江苏南京210008；2中国药科大学，江苏南京210009 色谱柱和流动相的选择经反复试验，用氨基键合硅胶色谱柱；以乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(50：50)为流动相；流速为1.0 mL/min。理论塔板数按鸟氨酸峰计算应不低于5000。在此色谱条件下，供试品及对照品的HPLC色谱图见图1。鸟氨酸与门冬氨酸及氯离子峰的分离度均大于9.0。 备注：由于硅胶氨基柱耐受性差，很难达到理论塔板数的要求，所以客户使用XBridge Amide 4.6x250 mm，5pm， 按照上述方法，耐受性及理论塔板数均符合要求。谱图见： 糖肽(具体条件参考应用资料：2016耗材手册 P164) 选择能够兼顾分离度需要与样品分析通量要求的色谱柱柱长。 还有牛奶/提子麦片/啤酒/食用糖/蜂蜜/炸土豆/止咳糖浆(BEHAmide文集) 抗坏血酸及异抗坏血酸(具体条件参考应用资料： WA60102) 色谱条件 人参皂苷(具体条件参考应用资料： BEH Amide_Ginseng Root Powder_wa64083) 复方丹参滴丸 复方丹参滴丸 Fu Fang Danshan Diwan 【处方】丹参三七冰片 【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。 【色谱条件与系统适应性试验】用Waters ACQUITY UPLC HSST3(柱长为100 mm， 内径为2.1 mm， 粒径为1.8 pm)色谱柱，以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A，以0.02%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.4ml；检测波长为280nm；柱温为40℃。理论板数按丹参素峰计算应不低于8000。 8 70.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00Minutes 色谱条件 OH HO. 色谱柱： ACQUITY BEH Amide 2.1 x50 mm 1.7 um 部件编号： 186004800 流动相A： 乙腈/含0.04%氨水的10mM乙酸铵pH9.0 50：50 流动相B： 乙腈/含0.04%氨水的10mM乙酸铵pH9.0 90：10 流速： 0.5ml/min Time %A %B 0.0 0.1 99.9 3.50 70.0 30.0 3.51 99.9 7.50 99.9 注入体积： 5ul 稀释剂： 0.2%甲酸乙腈/甲醇75：25 柱温： 30°C 波长： 265 nm >OH HC OH HC Nicotinamide Pyridoxal Riboflavin (即峰1) (即峰2) (即峰3) CH O HO H.C -OH HO HO Nicotinic acid Thiamine (即峰5) Ascorbic acid (即峰4) (即峰6) CI O HC CH CH 0 CH Folic Acid (即峰8) HO HO -CH B12 (即峰7) 乙酰胆碱(具体条件参考应用资料： LC/MS Isocratic Separation of Neurotransmitters on XBridge HILIC) 色谱条件 色谱柱： XBridge HILIC 21 x 50 mm 3.5 pum 部件编号： 186004432 H3C .OH .CH3 流动相A： 含0.125%甲酸的10mM甲酸铵水溶液 H3C CH3 流动相B： 含0.125%甲酸的10mM甲酸铵 CH3 在乙腈：甲醇：水 90：5：5 Acetylcholine (Ach) Choline (Ch) 等度的模式 流动相比列： 10%A：90%B 流速： 0.5 ml/min 注入体积： 10pl 稀释剂： 0.2%甲酸乙腈：甲醇 75：25 样品浓度： 5 ng/ml 柱温： 30°C 检测器： 质谱 仪器： ACQUITY UPLC配置TQD LC条件 仪器： ACQUITY UPLC系统 色谱柱： XBridge BEH Amide XP， 2.1 x75 mm， 2.5 pm货号： 186006090 流动相A： 95：5HO：ACN w/100mM NHHCOO(pH 3.0)流动相B： 85：15 H2O：ACNw/30mM NHHCOO(pH 3.0) 初始的流动相条件是100%的流动相A，在3.5分钟内流动相B升高到30%。然后在0.1分钟内流动相A回到100%，运行1.4分钟。流速为0.5 mL/min。进样体积为20 uL。 质谱条件： 仪器： Waters Xevo°TQ-S质谱仪 离子源： ESI+ 图1.分别使用 Waters XBridge BEH Amide XP 和 XBridge BEH HILICXP色谱柱分 析一元胺类化合物的色谱图。分析物：1-NMS， 2-5-HT， 3-DA， 4-EP， 5-NE 卡因类局部麻醉药(具体条件参考应用资料：720004737ZH_利用CORTECS UPLC色谱柱改善分离度) H2N 利多卡因 布他卡因 (即峰1) (即峰2) H；N 丁卡因 (即峰3) 普鲁卡因 (即峰4) HN 普鲁卡因胺 (即峰5) LC条件 梯度条件如表1所示，包含初始平衡条件，随后缓慢上升且流速增大，以重新平衡色谱柱。整个循环时间为4.0 min。 MS条件 MS系统： Xevo TQ-S 电离模式： ESI+ 毛细管电压： 0.5 kV 锥孔电压： 视化合物而定(见表2) 去溶剂气流速： 900L/h 锥孔气流速： 150L/h 去溶剂气温度： 550℃ 源温度： 150℃ 梯度： 时间 流速 %A %B 100.000 100.02.0 10.0 90.02.1 10.0 90.02.5 30.0 70.02.6 100.03.9 100.0 4.0 100.0 图1.儿茶酚胺和变肾上腺素的名称、分子结构和logP值。 图2B.儿茶酚胺和变肾上腺素在ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(1.7 pm， 2.1x100 mm)上得到的色谱图。代表性方法空白。所有化合物的内源性浓度列于表3中。 吗啡代谢物(具体条件参考应用资料：720004739ZH_CORTECS色谱柱应用文集_WA64662) 去氨加压素(具体条件参考应用资料：720004056EN) 色谱条件： ACQUITY UPLC System with Binary Solvent Manager， Column Manager， and Sample Manager 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 um 2.1x100 mm 柱温： 45℃ 梯度： 30 to 95% organic over 3.5 min 质谱条件 质谱系统： Xevo TQ-S 质谱模式： Positive ion electrospray MS/MS 质谱切换： 535-328 Figure 2. LC/MS/MS chromatogram of the desmopressin Mid-LevelQC. 检测血浆中脂类物质如：卵磷脂(具体条件参考应用资料：720004048EN) 三聚氰胺(具体条件参考应用资料：婴幼儿配方乳粉和液态奶中三聚氰胺的测定) 色谱条件 TQD质谱方法 离子化方式： ESI+毛细管电压(kV)： 3.0脱溶剂气流量(L/Hr)： 900锥孔气(L/Hr)： 50离子源温度(℃)： 150 脱溶剂气温度(℃)： 400 MRM条件 MRM Transitions Dwell Time Cone Voltage Collision Energy (sec)(V)(eV)127>850.054017127>680.054025 氨基糖苷类抗生素(PFP)(具体条件参考应用资料：720004512ZH_UPLC/MS/MS测定肉类和乳品中的氨基糖苷类抗生素) UPLC条件 系统： ACQUITYUPLC 色谱柱： ACQUITY HSS PFP 21x100 mm， 1.8 um 部件号： 186005967 进样量： 30 pL 温度： 35℃ 流动相A： 20 mM HFBA水溶液 流动相B： 20 mM HFBA乙腈溶液 流速： 0.50 mL/min 梯度： 20%B初始条件，7分钟内线性梯度增至80%B，保持8分钟，浓度降回至20%B，持续8.1分钟。重新平衡，保持10分钟。 质谱条件 质谱仪： ACQUITY TQD 模式： 正离子电喷雾(ESI+) 图1.氨基糖苷类的化学结构。 毛细管电压： 3.0 kV 萃取锥孔电压： 3.0V 离子源温度： 130℃ 锥孔气体流速： 20 L/h 脱溶剂温度： 450°℃ 脱溶剂气体流速：!900 L/h 碰撞气体： 氩气，流速0.20 mL/min 图2.由加样浓度为 10 pg/kg(ppb) 的牛奶得到的 UPLC/MS/MS色谱图。 氨基糖苷类抗生素(HILIC)(具体条件参考应用资料：使用CORTECS HILIC色谱柱快速高效分析10种常见氨基糖苷类抗生素) English MRM Retention LOQ Compound Name Transition Time(min) (ng/mL) 468.3/163.1 妥布霉素 Tobramycin 468.5/324.1 1.87 500 478.4/156.7 庆大霉素 Gendamicin 478.4/321.8 2.10 100 卡那霉素 Kanamycin 485.2/162.5485.2/323.7 1.75 100 528.3/177.1 潮霉素B HygromycinB 528.3/352.1 1.66 100 539.9/216.6 安普霉素 Apramycin 539.9/377.8 1.87 100 586.3/163.1 丁卡那霉素 Amikacin 586.3/264.4 1.80 100 新霉素 Neomycin 615.4/108.8 615.4/278.8 0.40 100 大观霉素 Spectinomycin 332.8/139.6 332.8/111.6 0.90 50 链霉素 Streptomycin 581.9/262.7 581.9/245.7 1.28 50 双氢链霉素 Dihydrostreptomycin 583.9/262.7583.9/245.7 1.31 50 表1.十种常见氨基糖苷抗生素检测结果信息。 糖异构体的分离(参考文献：720005609ZH) LC条件 LC系统： ACQUITY Arc 数据系统： Empower 3 运行时间： 40.0 min色谱柱： XBridge°XP BEH Amide 2.5 pm， 3.0 x150 mm柱温： 85C流动相A： 90%乙腈：5%异丙醇：5%水* 流动相B： 80%乙腈：20%水* 流速： 0.8 mL/min 进样体积： 1pL 时间 流速 %A %B初始 0.8 100 04.5 0.8 100 018.0 0.8 0 10025.0 0.8 0 100251 0.8 100 040.0 0.8 100 0 *均含有500 ppb盐酸胍和0.05%二乙胺。 检测自来水中的丙烯酰胺(具体条件参考应用资料：检测自来水中的丙烯酰胺) 色谱条件 流动相A为0.01%甲酸水，流动相B为甲醇，流速0.25 ml/min， 初始流动相为98%A和2%B，到1.5分钟线性变化到90%A和10%B， 1.6min变回到起始梯度，样品分析总时间为2 min。样品(根据需要加内标0.75 ug/L)过膜后直接进样，进样量20pL。 质谱条件 采用ESI正离子模式，毛细管电压3.5kV，离子源温度120℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气600L/h， 锥气体20L/h，碰撞气0.17ml/min。内烯酰胺(Acrylamide)和丙烯酰胺-d(D3-Acrylamide)定量离子对分别为71.9>54.9和74.9>57.9，定性离子对均为71.9>43.5，锥孔电压和碰撞能分布都为24V和9eV。 图2添加内标的自来水及其加标样品色谱图 左自来水，右为自来水加标0.5ug/L， 每个样品上方为内标，下方为丙烯酰胺 图1.敌草快和百草枯的结构式。 化合物 MRM 锥孔电压(V) CID (eV) 敌草快 183.1>157.1 50 25 183.1>130.1 50 30 185.1>170.1 38 22 百草枯 171.1>77.0 45 40 表1.UPLC-MS/MS分析中敌草快和百草枯所用的MRM通道。 图2.10 ppb加标小麦面粉样品的 UPLC-MS/MS 提取离子色谱图。 经证实， CORTECS UPLC HILIC分离适合与EU所采用的快速筛选法配合使用。在UPLC-MS/MS分析前，提取样品仅经过了过滤与稀释。CORTECS UPLC HILIC法采用了等度方法(50：50乙腈/缓冲液)。因此，萃取样品仅需使用乙腈进行1：1的稀释即可实现优异的色谱性能。土豆与小麦面粉中敌草快的定量限(LOQ)低于10 ng/g。土豆中百草枯的LOQ低于10ppb， 而小麦面粉中百草枯的LOQ约为10 ppb。 想要了解更多的应用及解决方案，请联系当地的沃特世销售人员或电话咨询：800(400)-820-2676 ACQUITY UPLC BEH AMIDE色谱柱应用文集文件编号：：1WA64081 CORTECS 色谱柱应用文集文件编号：720004739ZH HILIC综合指南亲水作用色谱 Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. HILIC 综合指南 文件编号：715002531 沃特世科技(上海)有限公司 地址：上海市浦东新区金海路1000号 金领之都13栋 邮编：201206 电话：021-6156 2666 传真：021-61562777 北京分公司 地址：北京市朝阳区铜牛国际大厦 光华路15号院2号楼9层 邮编：100026 电话：010-52093866 传真：010-52932298 广州分公司 地址：广州市荔湾区中山七路50号 西门口广场1707-08室 邮编：510170 电话：020-28296555 传真：020-28296556 成都分公司 地址：成都市高新区科园南路88号 天府生命科技园孵化楼C1栋411室 邮编：610023 电话：028-67653588 传真：028-6765 3580 沃特斯中国有限公司 地址：香港新界沙田科学园 科技大道西16号907-908室 电话：852-29641800 扫一扫，关注沃特世微信 传真：852-25496802 全国免费售后服务热线： 800(400)820 2676WWw.waters.com Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters， XBridge， Atlantis， CORTECS， Alliance， ACQUITY， QDa， ACQUITY UPLC， Xevo， MassLynx和The Science of What’s Possible沃特世公司的注册商标。所有其他商标属于各自所有者。 O2017沃特世公司中国印制 2017年6月720006044ZH THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 本应用文献介绍了在制药、食品、生物分析、临床检测等方面的极性化合物的典型应用,帮助大家理解相关方面的信息