黄芪中黄芪甲苷的含量检测方案(液相色谱仪)

2 39001woThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.SCIENTIFI CPart of Thermo Fisher Scientific 张艳海叶明立金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：在线固相净化；高效液相色谱法；黄芪；中药；黄芪甲苷，电雾式检测器( CAD) Key words： online solid-phase purification， CAD， HPLC，Radix Astragli，astragaloside IV， TCM 引言 黄芪是常见的补益类中药，也是中药方剂配伍及其制剂中使用频率较高的中药。其中黄芪甲苷是主要活性成分，药品标准中常将其作为质量评价指标成分。但黄芪甲苷的测定有两个难点，，一是黄芪甲苷是末端吸收的物质，采用UV末端波长或ELSD检测，灵敏度较差；二是黄芪甲苷在黄芪中含量较低，基质成分复杂。2010版药典一部中，黄芪药材的前处理工艺采用正丁醇萃取，经过D101大孔吸附树脂离线纯化后，用HPLC-ELSD检测，前处理步骤较多，黄芪甲苷回收率不高。电雾式检测器(CAD)是一种通用型检测器，具有宽的动态范围和低至ng级的检测灵敏度，它的检测不依赖于分析物光学性质，也不依赖于分析物在气相中离子化的能力，能够检测所有非挥发性的物质，同时适用于各种分离模式，如等度、梯度， HILIC， 离子交换，SFC和SEC等。 本文利用双三元高效液相系统( Dual Gradient Liquid Chromatography，DGLC)， 采用在线净化方法结合电雾式检测器检测，对样品进行净化后再自动切换到分析柱上进行分析，系统连接方式见图1。这套系统还成功应用于归脾丸(浓缩丸)，补肾固齿丸，益气养血口服液和颈复康颗粒等含黄芪的中药复方样品的分析，测定了其中黄芪甲苷的含量。该方法可实现样品自动化处理，回收率高，在线SPE柱可重复利用等优点。 测试条件 仪器： Ultimate DGP 3600系列，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵；带有一个六通阀的柱温箱；紫外检测器。连接图见图1。 富集柱： Acclaim@PAlI (3umx4.6mm×50mm)。 分析柱： AcclaimC18(5pmx4.6mm×150mm)。 柱温：35℃。 CAD： 雾化器温度：30℃； 气体(N2)压力： 35.0psi； 数据采集频率：5Hz 流速：1.0mL/min 流动相组成及流速见表1；梯度洗脱：见表2。 图1-1.阀1-2位相通时连接图 图1-2.阀1-10位相通时连接图 表1.流动相组成及流速 富集泵(left pump) 分析泵(right pump) 流动相A Water 流动相B MeOH ACN 时间(min) (A%) (B%) 时间(min) 阀 0 100 5 0 1-2 3 100 25 24 10-1 30 5 25 24.9 1-2 40 5 75 40.1 100 95 50 100 5 取黄芪饮片，粉碎成中粉约4g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，加2%KOH/甲醇溶液50mL， 称定重量，冷浸过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，以50%盐酸溶液调至中性，转移至10mL量瓶中，加水定容，即得。 图2.黄芪甲苷对照品色谱图 结果和讨论 实际样品分析 图3.黄芪饮片(蜜炙)色谱图 图4.黄芪饮片(生品)色谱图 图5.归脾丸色谱图(进样体积100pL) 图6.益气养血口服液色谱图(进样体积50pL) 图7.补肾固齿丸色谱图(进样体积50uL) 图8.颈复康颗粒色谱图(进样体积50uL) 4.2黄芪药材测定结果 表4-1.不同测定方法测得药材中黄芪甲苷的含量 方法名称 黄芪(生品)含量% 黄芪(蜜炙)% Online-SPE 0.166 0.063 常规方法 0.136 “1”参考2010版药典一部黄芪项下黄芪甲苷的含量测定方法。 表4-2黄芪.(蜜炙)不同提取方法测得黄芪甲苷含量 方法名称 黄芪(蜜炙)% 回流提取 0.063 ASE提取 0.069 “2”ASE提取条件为： 溶剂：甲醇；萃取温度：140℃；静态萃取时间10分钟，循环3次；吹扫体积：60%，吹扫时间：90s 讨论 提取溶剂选择：黄芪甲苷在药材中主要是以其结构中C3位木糖配基上不同位置羟基的乙酰化物的形式存在，原化合物实际含量很低，不经特殊处理，甲醇提取后直接测定含量较低。目前是利用其乙酰化物在碱性溶剂中可还原为黄芪甲苷的特点，在供试品处理过程中将部分乙酰化物转化为黄芪甲苷，提高其含量，以满足检测需要。这种方法多年来已广泛用于控制黄芪药材和制剂的质量。因此在药材的提取溶剂选择上，本实验采用2%KOH甲醇溶液进行提取，结果表明黄芪甲苷的提取率较高，方法重现性较好。 提取方法：本实验初步对比了ASE提取与回流提取方法，结果表明在保证与回流提取法黄芪甲苷含量测定结果一致的前提下， ASE提取方法可以显著减少药材的提取时间。 一维净化柱选择：为保持一维和二维的选择性的差异，本实验采用PAIIC18柱， 及甲醇-水梯度洗脱方式。在柱长选择上，对比了50mm与10mm两种规格的净化柱，10mm小柱对于黄芪药材可以到达较好的净化效果，但对于基质较复杂的复方中药，50mm小柱较好，综合考虑，确定了50mm的PAⅡC18作为一维的净化柱。 结论 与常规分析方法比较，在线前处理的方法具有以下几个优点： 1)方法的专属性较好。通过一维和二维色谱柱选择性差异和洗脱溶剂上的差异，可以保证方法具有较好的分离干扰基质成分的效果。 2)对分析柱有保护作用。中药尤其是复方中药的样品基质成分较复杂，对色谱柱污染较大，色谱柱的使用寿命会降低。采用在线纯化方法，通过阀切换，可以避免污染物进入分析柱，从而延长了分析柱的使用寿命。 3)方法简便，快速。常规分析方法包括正丁醇萃取和大孔树脂的离线除杂处理过程，样品制备时间较长，且由于前处理步骤较多，最后的测定结果误差也较大。采用在线净化方法，样品提取后，直接进样分析，方法简便，且结果精密度、重现性较好。 ( [1]. ChP(中国药典).2010.VolI(一部)：283 ) ( [2].陈海明.HPLC-ELSD法测定黄芪及其复方制剂 中黄芪甲苷的含量.药物分析杂志，2007，27(3)： 426 ) thermoscientific.com C 2012 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and itssubsidiaries. Specifications， terms and pricing are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 800 8105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548    黄芪是常见的补益类中药，也是中药方剂配伍及其制剂中使用频率较高的中药。其中黄芪甲苷是主要活性成分，药品标准中常将其作为质量评价指标成分。但黄芪甲苷的测定有两个难点，一是黄芪甲苷是末端吸收的物质，采用UV末端波长或ELSD检测，灵敏度较差；二是黄芪甲苷在黄芪中含量较低，基质成分复杂。2010版药典一部中，黄芪药材的前处理工艺采用正丁醇萃取，经过D101大孔吸附树脂离线纯化后，用HPLC-ELSD检测[1]，前处理步骤较多，黄芪甲苷回收率不高。电雾式检测器（CAD）是一种通用型检测器，具有宽的动态范围和低至ng级的检测灵敏度，它的检测不依赖于分析物光学性质，也不依赖于分析物在气相中离子化的能力，能够检测所有非挥发性的物质，同时适用于各种分离模式，如等度、梯度，HILIC，离子交换，SFC和SEC等。    本文利用双三元高效液相系统（Dual Gradient Liquid Chromatography，DGLC），采用在线净化方法结合电雾式检测器检测，对样品进行净化后再自动切换到分析柱上进行分析，系统连接方式见图1。这套系统还成功应用于归脾丸（浓缩丸），补肾固齿丸，益气养血口服液和颈复康颗粒等含黄芪的中药复方样品的分析，测定了其中黄芪甲苷的含量。该方法可实现样品自动化处理，回收率高，在线SPE柱可重复利用等优点。