未知蛋白中总蛋白定量检测方案(紫外分光光度)

表2、未知样品的浓度R2=0.99882 介绍使用LAMBDA UV/Vis总蛋白的定量方法是一种建立最久的分光光度计测定基础且重要的生物科学实验。UV/Vis总蛋白： Bradford法分光光度计被广泛用于蛋白的测定。本应用报告描述了经典的蛋白方法，Bradford法。使用LAMBDA 464 UV/Vis 分光光度计快速获取数据，并使用UVLab软件进行分析。 原理 酸性溶液中，考马斯亮蓝和样品中的蛋白组分结合。结果造成该染料的最大吸收从465nm红移到595nm。595nm的吸光度和蛋白的含量成正比。 本方法中，颜色反应非常快，可在2分钟内完成，并保持1小时稳定。Bradford方法比Lowry方法更加灵敏，使用微量法可以测量1~20ug的蛋白。并且Bradford方法更快，并几乎不受非蛋白组分的干扰。 试剂和仪器 1、Bradford试剂 考马斯亮蓝G-250染料、磷酸和甲醇的混合溶液，使用去离子水进行5倍稀释并过滤。该稀释的溶剂可以稳定2周。 2、蛋白标准物-牛血清丙种球蛋白(或者牛血清清蛋白-BSA)0.1mg/ml 3、未知蛋白 4、盐溶液(8.5g/l) 5、LAMBDA 465 UV/Vis分光光度计 6、UV Lab软件 7、比色皿(10mm光程) 实验过程 1、准备蛋白溶液：依照表1，在7个试管中混合蛋白和盐溶液。 2、加入5.0ml去离子Bradford试剂到标准溶液和未知样品中，混匀并静置5分钟。 3、在软件的定量模式的方法文件中，选择Bradford方法。 4、在定量标准模式，测量标准品2到6相对标准品1在595nm的吸光度。在1小时之内完成。 5、在定量样品模式，测量未知样品(样品7)。 6、制作标准品吸光度相对浓度的曲线。 7计算未知样品的浓度。 仪器参数 LAMBDA465的仪器参数如下设置： 实验设置 数据类型：吸光度 采样：单池 模式：快速(光谱数：1/扫描数：50/积分数：1/增益数：1) 实验方法 定量方法：Bradford方法 使用波长：595nm 曲线维度：1 Reagent Test Tube No. 1 2 3 4 5 6 0.1 mg/ml Standard Protein (ml) 0 0.1 0.4 0.6 0.8 1 Saline Solution (ml) 1 0.9 0.6 0.4 0.2 0 Concentration (ug/ml) 0 10 40 60 80 100 图1、Bradford方法的实验设置 图2、Bradford方法的谱图 结果 LAMBDA 465的仪器参数如下设置： 1、校准曲线 图2显示了蛋白标准溶液的光谱，图3显示了得到的校准曲线。曲线的相关系数R²是0.99885。 2、未知蛋白样品 结论 公式：Y=0.0021X+0.0933 Name Concentration (ug/ml) Dilution Factor Au (595.00) nm Sample 1 65.39 1.0 0.2279 使用LAMBDA 465 UV/Vis分光光度计和UVLab软件，进行了蛋白的定量分析。光谱快速采集，并且灵敏度很高。UV Lab软件的定量模式有效的进行了数据处理和定量分析。 Absorbance(Au) 图3、Bradford方法的校准曲线 金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs 版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。