MPDS混合物,MPDS大肠杆菌中蛋白质组学检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要] ■ Waters ACQUITY UPLC M-Class在蛋白质组学纳升级应用中的性能 Christopher J. Hughes、 Johannes P.C. Vissers 和James l. Langridge 沃特世公司(英国威姆斯洛) 应用优势 ACQUITY UPLC M-Class系统能够在蛋白质组学应用中以纳升级流速运行，具有以下优势： 出色的色谱保留时间重现性、峰容量和灵敏度 无论是分析相对简单的样品还是较为复杂的胰蛋白酶酶切的肽混合物，都能展现优异的性能 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC M-Class系统SYNAPT@G2-SiProteinLynx Global SERVERTM(PLGS)软件 关键词 简介 纳升级色谱是自下而上或鸟枪法蛋白质组学实验的理想之选。由于它能降低样品中低化学计量肽段的稀释效应，因此灵敏度比流速较高的分离方法更出色。将纳升级的色谱与采用数据非依赖型(DIA)、数据依赖型(DDA)或多重反应监测(MRM)采集模式运行的QToF质谱仪联用，能够提高分离的峰容量，从而改善分析结果，实现更高水平的蛋白质/肽定量和更低的检出限和定量限。 ACQUITY UPLC M-Clas系统能够以纳升到微升范围的流速实现直接液相分离，操作压力上限为15000 psi。该操作压力上限比nanoACQUITY@UPLC系统更高，因此我们可使用更长的亚2um颗粒填充色谱柱，从而达到最大分离效率。此外，也可在使用较短的色谱柱时提高流速以提高通量。 本应用纪要介绍了 ACQUITY UPLC M-Class系统出色的性能特征，展示了采用DIA HDMSE采集复杂的胰蛋白酶肽样品所得的典型结果。 MPDS混合物1， MPDS大肠杆菌， MS，HDMS， UPLC 实验样品 MPDS混合物1，含四种蛋白质的胰蛋白酶酶解物：乙醇脱氢酶、牛血清白蛋白、酵母烯醇酶和兔糖原磷酸化酶 MPDS大肠杆菌 方法条件 LC条件 LC系统： ACQUITY UPLC M-Class捕集柱： ACQUITY UPLC M-ClassSymmetry@Cg，100A，5pm，180 um x 20 mm， 2G，V/Mp捕集柱(部件号186007496) 捕集条件： 5uL/min的速度以0.1%甲酸的水溶液上样5分钟分析柱： ACQUITY UPLC M-Class HSS T3，100A， 1.8 pm， 75 pmx250 mm色谱柱(部件号186007474)柱温： 35℃洗脱流速： 300 nL/min 流动相A： 0.1%甲酸的水溶液 流动相B： 0.1%甲酸的乙腈溶液 梯度： 线性梯度，流动相B在30或 90分钟内从1%升至30% MS条件 仪器： SYNAPT G2-Si 采集模式： MS和HDMS模式 质量数范围： 50~2000 Da 积分时间： 0.2 s(MS)或0.5s(HDMSF) 数据管理 ProteinLynx Global SERVER (PLGS)软件 Spotfire(Tibco，美国马萨诸塞州波士顿) 结果与讨论 色谱性能是分析复杂混合物时的关键因素，其衡量标准是保留时间重现性和峰宽。依靠定量、无标记策略的数据采集方法也要依赖保留时间重现性在多次进样中对分析物进行定性和定量分析。此外，采用UPLC压力运行分析和使用填充较小颗粒的色谱柱能够使峰宽更窄，有助于实现较高峰容量的分离。更有效的分离能够提高非标记定量的数据处理算法的准确度。更好的分离不仅能解决色谱峰无法区分的问题，而且因为共洗脱干扰更少，还能清楚地解析紧密相关的母离子和碎片离子。 为了测定ACQUITY UPLC M-Class系统的保留时间重现性和峰宽，我们重复进样了六次MPDS混合物1，并采用30分钟的梯度来分离此酶解产物样品。所得色谱图如图1所示。图2显示了其中84种强度最大的肽段与其平均保留时间相比较的标准偏差。所有这些肽段均具有小于或等于2秒的出色标准偏差。图3显示了这些肽段的色谱峰宽的频率分布。多数洗脱峰的半峰全宽(FWHM) 为3.0~3.6秒或18nL溶剂体积，在该分离中相当于213的理论峰容量。 图2.六次重复进样25 fmol MPDS混合物1的分析结果中，84种强度最大的肽段的保留时间重现性(使用30分钟的梯度分离)。 在DIAHDMS采集中，碎片离子依据其离子淌度和洗脱时间与母离子相关联。与仅基于Tof的MSF(即不采用离子淌度分离技术)相比，用此方法分析样品能达到更高的蛋白质鉴定率。图4显示了分析100ng相对复杂的大肠杆菌胞质胰蛋白酶酶解物所得的典型色谱图。在本次分离中，洗脱峰的平均FWHM峰宽为0.17 min， 因此理论峰容量为412。经PLGS软件处理之后，蛋白质鉴定结果超过1100，同时鉴定出了20000多种肽段，如图5所示。 图4.进样分析100 ng MPDS大肠杆菌样品所得的典型HDMS色谱图。 图5.100ng大肠杆菌进样分析PLGS检索结果。 结论 本应用纪要重点介绍了ACQUITY UPLC M-Class系统采用纳升级流速运行时的性能特点，展示了将其用于分析复杂的胰蛋白酶肽混合物时的适用性。保留时间重现性非常出色且标准偏差小于2秒，而且大多数肽段在短梯度度离中都达到了3.6秒的FWHM峰宽。分析复杂混合物时， ACQUITYUPLC M-Class系统与采用HDMSE模式运行的SYNAPT G2-Si质谱仪联用，展现出了卓越的蛋白质鉴定率。 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 Waters、 The Science of What’s Possible、ACQUITY UPLC、nanoACQUITY、UPLC、Symmetry和SYNAPT是沃特世公司的注册商标。ProteinLynx Global SERVER是沃特世公司的商标。 成都：028-67653588 其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ACQUITY UPLC M-Class在蛋白质组学纳升级应用中的性能 ACQUITY UPLC M-Class在蛋白质组学纳升级应用中的性能 ACQUITY UPLC M-Class系统能够在蛋白质组学应用中以纳升级流速运行，具有以下优势：1.出色的色谱保留时间重现性、峰容量和灵敏度2.无论是分析相对简单的样品还是较为复杂的胰蛋白酶酶切的肽混合物，都能展现优异的性能