猪肉试样中莱克多巴胺检测方案(气质联用仪)

东西分析 猪肉中莱克多巴胺的 GC-MS分析 王成娟 摘要：本文建立了猪肉中莱克多巴胺的 GC-MS 分析方法。样品用高氯酸溶液匀浆，进行超声加热提取，在碱化的条件下用乙酸乙酯萃取，然后用稀盐酸反萃取，固相萃取小柱净化，用4%氨化甲醇溶液洗脱，洗脱液经氮吹仪浓缩，经N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺 (BSTFA+TMCS 99：1)衍生后进气质联用仪分析，外标法定量。 关键词：猪肉，莱克多巴胺，GC-MS，外标法 莱克多巴胺，英文名称 ractopamine，分子式 C18H23NO3，分子量 337.85， CAS号97825-27-7，可溶于水和乙醇，属于苯乙醇胺类的B2-肾上腺素受体激动剂，能改变能量分配，提高肌肉生长速度，从而改善猪的体重和体瘦肉率。 β2-兴奋剂的检测方法很多，有酶联免疫法，气质联用法，高效液相色谱法，液质联用法等。本文建立了猪肝中莱克多巴胺的 GC-MS分析方法，样品用甲醇超声提取，提取液经固相萃取小柱净化，净化液氮吹仪浓缩至至，经N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA+TMCS) 衍生后进气质联用仪分析，外标法定量。 结构式： 1实验部分 1.1设备和试剂 设备：气质联用仪 GC-MS3100，分析天平(感量：0.0001g)，超声波仪，酸度计，涡旋振荡器，固相萃取仪，阳离子固相萃取小柱(SCX小柱， 60mg， 3mL)，氮吹仪，离心机，恒温箱；50ml磨口玻璃离心管，5ml 磨口玻璃离心管，均具塞。10mL磨口具塞比色管，容量瓶，胶头滴管，移液枪。 所有试剂，如未注明纯度，均指分析纯；所有实验室用水均为去离子水。 试剂：莱克多巴胺标准品(纯度≥99%)，甲苯(分析纯)，衍生试剂 BSTFA+TMCS (99：1)，高氯酸，碳酸钠，氯化钠，乙酸乙酯，盐酸，甲醇(色谱纯)，氨水，去离子水。 1.2样品前处理 1.2.1提取 称取粉碎好的猪肉肉馅5g(精确到0.01g)于50ml离心管中，加入10ml 0.1mol/L高氯酸溶液，于涡旋振荡器上涡旋 1min ，放入超声波仪中超声20min，取出置于80℃恒温箱中加热30min ， 冷却后以 5000r/min 离心5min，取上层清液。在残渣中再加入10ml0.1mol/L 高氯酸溶液，涡旋振荡 30s后离心 5min，将两次上清液合并。用碳酸钠溶液(10%)调 PH至10， 加入4g氯化钠，涡旋混匀，加入10ml乙酸乙酯，涡旋混合1min，离心5min ， 吸取上层有机相于另一离心管中；在残渣中再加入10ml乙酸乙酯，涡旋混合1min ，离心5min ，吸取上层有机相合并提取液。然后于提取液中加入4ml0.1mol/L 盐酸溶液，涡旋混合1min，离心 5min ， 吸取下层溶液同样步骤重复萃取一次，合并两次萃取液，调PH至2.0，作为备用液。 1.2.2净化 依次用5ml 甲醇、5ml水、5ml 0.03mol/L 的盐酸溶液润洗阳离子固相萃取小柱，取上述备用液过柱，弃去流出液，依次用5ml水和5ml甲醇淋洗柱子，弃去流出液，再用5ml4%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。 1.2.3衍生化 在50℃下于氮吹仪上吹干上述洗脱液，加入400pL 甲苯，涡旋 30s，再加入 100pL衍生化试剂BSTFA+TMCS3 (99：1)，涡旋振荡 1min ，在80℃的烘箱中加热衍生1h，完成后取出冷却至室温，待GC-MS分析。 1.3 标准曲线的制备 准确量取适量莱克多巴胺标准储备液于容量瓶中，用甲醇稀释成浓度为 0.05mg/L，0.1mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L 系列标准工作溶液，各取0.5ml在50℃下氮吹至干 东西分析 (与样品液同步氮吹)，然后按上述衍生化步骤进行衍生。以莱克多巴胺标准溶液浓度为横坐标，对应的定量离子的峰面积为纵坐标建立标准曲线。 1.4分析条件 色谱条件：Equity-5(30mx0.25 mmx0.25pm)石英毛细管柱，柱前压：80Kpa， 柱流量：1ml/min 进样口：300℃，柱箱：100℃保持1min，以 20℃/min 速率升至290℃保持5min。不分流进样，分流比：30：1，溶剂延迟：8min。 质谱条件：EI源，电子能量： 70eV，离子源温度：200℃，接口温度：290℃，扫描方式：全扫描定性，扫描范围：44.5~400u；选择离子扫描(SIM)定量，监测离子：58，179，234，250；定量离子：58，电子倍增器高压：1550. 2实验结果 2.1标准样品谱图 -TIC 图1莱克多巴胺标样衍生物全扫描 TIC图 320.000- -TIC 图3莱克多巴胺标样衍生物 SIM 扫描TIC图 (1ug/ml) 图4莱克多巴胺标准样品衍生物MC图 图5莱克多巴胺衍生物选择离子扫描质谱图 2.2品普图 图6猪肉实际样品选择离子扫描TIC图 图7猪肉实际样品加标选择离子扫描 TIC图(0.05ug/g) 图8猪肉实际样品加标选择离子扫描 TIC 图(0.10ug/g) 2.3空白实验 除不加猪肉样品外，采用与实际样品完全相同的处理和测定步骤进行平行操作。空白实验结果谱图如下。 图9空白选择离子扫描 TIC图 2.4回收率 准确称取 5g经绞碎过的猪肉样品，添加浓度为 0.05ug/g、0.1ug/g，每个浓度平行两次试验，按照上述方法进行前处理，测得平均回收率分别为76%和80%。 2.5标准曲线及检测结果 以莱克多巴胺标准溶液浓度为横坐标，相应的定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。莱克多巴胺衍生物保留时间为13.42 min ， 在测定浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为0.997， 线性方程为y=3E+06x+2266.5，相对标准偏差≤15%，加标回收率大于75%。此猪肉中未检出莱克多巴胺。 3结果与讨论 3.1实验过程注意事项 1)用氮吹仪浓缩过程中，要严格控制氮气流量，不能太大，否则样品会在氮吹的过程中损失，从而导致实验失败。 2)由于衍生试剂对潮气比较敏感，因此一定要吹干，然后才能加衍生试剂衍生。空气湿度亦对实验有影响。 3)衍生用的甲苯最好用无水硫酸钠除下水。 4)莱克多巴胺衍生物不稳定，容易分解，不可放置时间太长。 5)定性定量离子的选择：参照标准中选择m/z 163，192，234，250作为监测离子，但实验过程中发现 m/z 58，179，234，250响应值更高，背景噪声更小，其中m/z58为莱克多巴胺衍生物的基峰，故定量离子选择 m/z58 更加合理。 3.2结论 本文部分参照“农业部958公告-4-2007"标准，建立了猪肉中莱克多巴胺的 GC-MS分析方法；该方法在测定浓度范围内线性关系良好，加标回收率大于75%，精密度良好；实验结果表明，该方法适合于莱克多巴胺的定性、定量测定。 -- -