猪肉中盐酸克伦特罗检测方案(气质联用仪)

区-TIC 猪肉中盐酸克伦特罗的 GC-MS分析 王成娟 摘要：本文文照标准"NY/T 468-2006"建立了猪肉中盐酸克伦特罗的GC-MS分析方法。对样品在碱化的条件下用乙酸乙酯提取，然后用稀盐酸反萃取，萃取的样液 PH调至5.2后过 SCX 固相萃取小柱净化，净化液用氮吹仪浓缩，经衍生试剂(BSTFA+TMCS 99：1)衍生后，于气相色谱-质谱联用仪上进行测定；外标法定量。 关键词：猪肉，盐酸克伦特罗， GC-MS， 外标法 盐酸克伦特罗，属于β2兴奋剂类，俗称瘦肉精，英文名称 clenbuterol，分子式C12H18CI2N2O-HCI， CAS号37148-27-9，熔点172~175℃，白色微结晶粉末，易溶于乙醇，甲醇，水，微溶于氯仿，不溶于苯。 克伦特罗，莱克多巴胺，沙丁胺醇，特布他林等统称为瘦肉精，均属于β2兴奋剂类，其具有促进动物体内脂肪代谢，增加蛋白质合成，显著提高酮体瘦肉率的作用，因此一些不法分子受经济利益驱使将其添加入饲料中，从而达到节约成本，提高瘦肉率的目的。克伦特罗等易在动物体内残留积累，人食用了含有瘦肉精的猪肉后积累到一定程度会中毒，如心慌，心跳加快，双手发抖等症状。 1：实验部分 1.1设备与试剂 1.1.1仪器及设备 气质联用仪 GC-MS3100(北京东西分析仪器有限公司)，固相萃取装置，氮吹仪，超声波仪，离心机，50mL具塞聚四氟乙烯离心管，涡旋混合器，恒温箱，分析天平(感量： 东西分析 0.0001g)，移液枪(20pL~200uL， 100pL~1000pL)，离心管(5mL，10mL)， 固相萃取小柱： SCX小柱， 60mg， 3mL 1.1.2试剂和溶液 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯。 克伦特罗标准品(纯度99.3%)，甲醇(色谱纯)，正己烷，氨水，盐酸(优级纯) 谷生试剂：N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺(99%BSTFA)和三甲基氯硅烷(1%TMCS )0.1 mol/L盐酸溶液：取盐酸(4.4)9mL， 加水至500mL，摇匀，即得。 30mmol/L盐酸容液：取0.2mol/L盐酸溶液(4.5)15mL，加水至100mL，摇匀，即得。 4%氨化甲醇溶液：取氨水4ml于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，充分混匀，即配即用。 10%碳酸钠溶液：称取10g无水碳酸钠溶解于90mL去离子水中混混即成。 2.5mol/L 氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠标准品 5g于50mL 容量瓶定容即成。 1.2标准溶液配制 精确称取适量的盐酸克伦特罗标准品，用甲醇1mg/mL 的标准储备液。然后将储备液用甲醇稀释成浓度为 0.05mg/L ， 0.2mg/L， 0.5mg/L，1mg/L标准系列溶液。 1.3羊品前处理 1.3.1试样提取 称取粉碎过的猪肉试样10g，置于50mL离心管中，加入15mL乙酸乙酯，再加入3mL10%碳酸钠溶液，于旋振荡器上涡旋60s，然后以5000r/min 的速度离心5min，吸取上层有机溶剂于另一离心管中，在残渣中再加入10mL 乙酸乙酯涡旋混合1min， 离心后吸取上层有机溶剂并合并提取液。在收集的有机溶剂中加入5mL 0.1mol/L 的盐酸溶液，漩涡混合30s， 以5000r/min 的速度离心5min， 吸取下层溶液，同样步骤重复萃取一次，合并两次萃取液， 用2.5mol/L 氢氧化钠溶液调节PH至5.2。 1.3.2试样净化 依次用5ml甲醇、5ml水、5ml 0.03mol/L 的盐酸溶液活化固相萃取柱，然后将上述萃取液上样至固相萃取小柱中，弃去流出液，依次用5ml水和5ml甲醇淋洗柱子，在溶剂流过固相萃取柱后，抽干小柱，再用5ml 4%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。 1.3.3衍生化 在50℃下于氮吹仪上吹干上述洗脱液，加入400pL 正己烷和100pL衍生化试剂BSTFA+TMCS (99：1)涡旋振荡 1min ，在80℃的烘箱中加热衍生 1h ，同时吸取0.5mL标准工作液加入到4.5mL4%氨化甲醇溶液中，用氮气吹干后同样品操作，衍生化完成后冷却至室温，转移至小样品瓶中供 GC-MS分析。 1.4分析条件 1.4.1色谱条件 EquityTM-5(30 mx0.25 mm×0.25pm)毛细管柱，载气：氦气(99.999%)，柱前压80KPa， 柱流量：1.0mL/min， 进样口温度：290℃，不分流进样，进样量：2uL 柱温程序：100℃保持1min， 然后以20℃/ min升至220℃保持6min，然后再以20℃/min升至290℃保持3min。 1.4.2质谱条件 EI源，电子能量：70eV，离子源温度：200℃，接口温度：290℃，溶剂延迟：5min，倍增器高压：1550全扫描定性，扫描范围：50~400u。 选择离子扫描定量，监测离子：86，212，243，262；定量离子：86。 2实验结果 2.1标准样品衍生物谱图 图1克伦特罗标样衍生物全扫描 TIC图 图2克伦特罗衍生物全扫描质谱图 -TIC 图3克伦特罗标样衍生物选择离子扫描TIC 图 (1ug/mL) 图4克伦特罗标样衍生物 SIM 扫描质谱图 ALLIC | 86.00 212.00243.00262.00 图5克伦特罗标样衍生物MC图 2.2标准样品直接进样谱图 图6克伦特罗标样直接进样 TIC 图(DIP-100 直接进样器分析) 图7克伦特罗标准品直接进样质谱图及检索结果 2.3样品谱图 图8猪肉样品选择离子扫描TIC图 厂-TIC 图9猪肉样品加标选择离子扫描 TIC 图(0.05ug/g) 2.4空白实验 除不加猪肉样品外，采用与实际样品完全相同的处理和测定步骤进行平行操作。空白实验结果谱图如下。 -TId 图10空白样品选择离子扫描 TIC图 2.5线性与精密度 以定量离子峰面积为纵坐标，标准样品浓度为横坐标绘制标准工作曲线，盐酸克伦特罗在测定浓度范围内线性良好，线性回归方程为y=7E+06x+1910，线性相关系数为0.9972。精密度良好，相对标准偏差≤14%。此猪肉样品中未检出盐酸克罗特罗。 2.6回收率 准确称取 10g经绞碎过的猪肉样品，做0.05ug/g 浓度水平的三个平行试验，按照上述方法进行前处理，测得回收率为85.2%. 2.7实验方法探讨 2.7.1衍生用溶剂选择 标准方法中采用甲苯作为衍生用的溶剂，但考虑到甲苯毒性比较大，故选择了比甲苯毒性小的正己烷来代替甲苯进行试验，结果表明效果良好，同时又减少了对实验人员和环境的危害。 2.7.2实验过程中注意事项 1)在衍生化过程中要注意防潮防水，因为衍生化试剂对水敏感；由于克伦特罗衍生物不稳定，易分解，故衍生化后的样品最好在 48h 内上机测试。 2)氮吹过程中，要严格控制氮气流量，否则样品会在氮吹的过程中损失，从而导致实验失败。3)4%氨化甲醇溶液最好现配现用。 3结果与讨论 本文建立了盐酸克伦特罗的 GC-MS分析方法；该方法在测定浓度范围内线性关系良好，精密度良好，实验结果表明，在保证样品前处理成功的前提下， GC-MS3100 可以满足此方面的分析测试工作。 -- --