母乳和奶粉中脂肪酸检测方案(气质联用仪)

2 吕建霞梁立娜 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 Key words： breast milk； milk powder； fatty acid； GC-MS 摘要： 以甲苯为溶剂，提取母乳和奶粉中的脂肪酸，经乙酰氯-甲醇进行甲酯化后，用气相色谱-质谱联用仪测定脂肪酸甲酯的含量，全扫描方式采集数据，单个离子进行定量。结果表明该方法线性良好，方法简便快速。 引言 脂肪是我们维持生命不可缺少的营养物质和基础代谢产物，它是机体内主要的能量储存形式。研究表明，脂肪的营养价值由脂肪酸决定。母乳是婴儿最好的食物。母乳中所含有的各种营养元素其种类、含量以及配比都是宝宝需要的“黄金标准”。 母乳中脂肪酸的种类很多，中链及中长链饱和脂肪酸；长链饱和脂肪酸(如棕榈酸)；单不饱和脂肪酸(如油酸)；多不饱和脂肪酸(如亚油酸，ARA，DHA，亚麻酸)。构成百分比分别为12.8%、29.6%、38.1%和19.5%。这种构成完全是婴幼儿期对脂肪酸的特定需要。虽然现在配方奶粉在不断努力朝着母乳化的方向发展，人们也越来越重视添加脂肪酸的种类、含量以及配比接近母乳，但是普通婴幼儿奶粉还是普遍存在脂肪酸吸收率低的问题。本文测定了母乳和奶粉中的脂肪酸的含量，计算其构成比例并进行比较。 实验部分 主要仪器设备与试剂 仪器：单四级杆气质联用仪， Trace GC Ultra ISQ， 美国ThermoFisher。 试剂：碳酸钠溶液，准确称取6g无水碳酸钠，加水溶解并定容至100mL；甲苯，色谱纯；乙酰氯甲醇溶液：量取40mL甲醇于100mL干燥的烧杯中，准确吸取5.0mL乙酰氯逐滴缓慢加入，不断搅拌，冷却后转移并定容至50mL干燥的容量瓶中；脂肪酸甲酯混合标准溶液，100mg/L。 称取0.5g待测样品于15mL干燥螺口玻璃管中，加入5.0mL甲苯，加入10%乙酰氯甲醇溶液6.0mL，旋紧螺旋盖，振荡混合后于80℃±1℃水浴中放置2h，期间每隔20min取出振摇一次，水浴后取出冷却至室温。将反应后的样液转移至50mL离心管中，分别用3.0mL碳酸钠溶液清洗玻璃管三次，合并碳酸钠溶液于50mL离心管中，混 匀，5000转/分钟离心约5 min。上上清液作为试液，气相色谱质谱仪测定。 样品的测定 上述衍生后的样品中，分析物浓度范围较宽，样品直接进样、稀释10倍、100倍、1000倍后分别进样，各组分分别以适舌稀释倍数的样品进行定量。用ThermoScientific全新一代的ISQ气相色谱-质谱联用仪进行全扫描检测。样品中脂肪酸甲酯可以用保留时间、质谱图进行定性分析，利用各物质特征离子峰面积进行外标法定量。 气相色谱-质谱条件：色谱柱TR-WAXMS， 30m，0.25mm， 0.25um；载气为高纯氦气(纯度99.999%)；流速1.2mL/min。进样口为PTV进样口，进样模式PTVsplitless， 不分流时间： 1min。 柱温采用程序升温条件如下：60℃(保持3min)；10℃/min 到160℃， 3℃/min到250℃(保持5min)。质谱接口温度为250℃；EI电离，电子能量为70eV；离子源温度220℃；采用全扫描检测方式，质谱扫描范围为35.00-350。 结果与讨论 标准样品中36种脂肪酸甲酯的色谱图如图1所示。 图1脂肪酸甲酯混合标准溶液的总离子流图 用标准样品配制成总浓度分别为2pg/mL， 10pg/mL，20 ug/mL， 50pg/mL， 100pg/ml的系列标准工作液，进样1pL， 然后按照以上所述的测定方法进行GC-MS测定，以标准物质的浓度为横坐标，以各标准物质的特征离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到各种脂肪酸甲酯的保留时间、定量离子(表1)。 待检测的36种脂肪酸甲酯中包含着同分异构体，对其进行完全分离分析常用的色谱柱为100m的极性柱。但100m的色谱柱分析时间较长，分析成本也较高，本方法 采用30m的WAX固定相极性柱，对36种脂肪酸甲酯也能达到较理想的分离，其中仅有两种同分异构体(C18：1n9t 和C18：1n9c)未达到完全分离，因此在分析结果中两种组分的含量做为总量(C18： 1n9)计算。采用本方法测定了母乳和市售三种奶粉的脂肪酸含量，为便于比较脂肪酒的含量，奶粉中的脂肪酸含量以冲调好的奶粉溶液来计。按照奶粉冲调说明，8.5g奶粉溶于60mL水中，按此比例换算，各检测结果列于表1。 表1母乳和奶粉中脂肪酸含量检测结果( mg/Kg ) 化合物 保留时间 该组分在标 定量离子仪器检测限 母乳样品 奶粉1 奶粉II 奶粉I 准品中的含量 (mg/L) C6：0 5.13 4% 74 0.4 ND 96.89 ND 41.12 C8：0 8.10 4% 74 0.1 41.56 269.3 5.508 325.2 C10：0 10.80 4% 74 0.1 228.40 270.2 8.675 228.4 C11：0 12.04 2% 74 0.1 1.00 3.434 0.1255 0.4289 C12：0 13.23 4% 74 0.1 679.64 1544 30.44 1679 C13：0 14.53 2% 74 0.1 1.78 5.293 0.4212 1.348 C14：0 16.07 4% 74 0.1 524.66 795.9 63.13 475.1 C14：1 16.69 2% 55 0.2 8.32 32.90 3.129 2.548 C15：0 17.85 2% 74 0.1 20.13 54.14 6.444 3.605 C15：1 18.55 2% 55 0.2 ND ND ND ND C16：0 19.37 6% 74 0.1 2534.27 2824 2140 1355 C16：1 20.39 2% 55 0.4 281.1 72.79 17.62 14.31 C17：0 22.07 2% 74 0.2 23.72 33.52 9.889 5.384 C17：1 22.62 2% 55 0.4 15.92 13.52 5.749 4.864 C18：0 24.41 4% 74 0.2 735.2 672.9 514.3 497.2 C18：1n9 24.82 6% 55 0.4 4378 3925 4901 7450 C18：2n6t 25.89 2% 67 0.8 2396 1982 3173 2728 C18：2n6c 26.07 2% 55 0.8 ND ND ND ND C18：3n6 26.60 2% 67 0.2 25.72 39.24 36.92 30.49 C18：3n3 27.45 2% 55 0.8 22.48 ND ND ND C20：0 29.27 4% 74 0.2 179.7 227.8 444.4 326.8 C20：1 29.71 2% 55 0.2 66.08 34.50 20.43 24.11 C20：2 30.85 2% 67 0.8 18.14 2.286 2.706 1.677 C20：3n6 31.50 2% 79 0.8 60.72 3.106 2.668 1.639 C21：0 31.75 2% 74 0.4 13.88 17.83 57.22 72.48 C20：4n6 32.02 2% 79 0.8 55.32 2.942 2.233 1.204 C20：3n3 32.43 2% 79 0.8 9.418 1.092 ND ND C20：5 33.58 2% 脂肪酸根据碳链长短和饱和度可分为如下四类：中链及中长链饱和脂肪酸(碳数≤12的饱和脂肪酸)；长链饱和脂肪酸(碳数≥13的饱和脂肪酸)；单不饱和脂肪酸(如油酸)；多不饱和脂肪酸(如亚油酸， ARA，DHA，亚麻酸)。本文所检测的母乳样品和三个奶粉样品中脂肪酸的成分百分比计算结果列于表2中。 表2母乳和奶粉样品中脂肪酸构成百分比 母乳样品 奶粉1 奶粉II 奶粉川 中长链饱和脂肪酸 7.57 16.76 0.39 14.84 长链饱和脂肪酸 31.11 34.27 24.89 16.15 单不饱和脂肪酸 38.13 31.36 43.04 48.90 多不饱和脂肪酸 23.19 17.61 31.69 20.11 C22：6ns是二十二碳六烯酸(DocosahexaenoicAcid，DHA)， (C20：5是二十碳五烯酸(EicosaPentaenoic acid， EPA)， C20：4n6是花生四烯酸(Arachidonic acid， ARA)。研究表明母乳中的DHA有益于婴儿的大脑和眼睛。DHA在视神经细胞及视网膜 组织中的含量高达40%-47%，如果食物中缺乏DHA，可使视网膜组织中DHA含量下降，从而导致视力下降。大部分婴儿配方奶粉中会添加这三种脂肪酸，研究表明这三种脂肪酸对婴儿智力和视力发育起到关键作用。本方法检测了市售三个品牌的Ⅲ段奶粉中的脂肪酸含量，结果见表1。由表1的结果可见，这三种脂肪酸在母乳中的含量远远高于在Ⅲ段奶粉中的含量。世界卫生组织(WHO)坚持推荐有条件的妇女采用母乳喂养婴儿。 实验结果表明，赛默飞世尔科技的全新一代ISQ单四极杆气质联用仪可以较好的应用于母乳和奶粉样品中脂肪酸的检测。 thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd its s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 400 6505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548 ThermoFisherSCIENTIFIC oThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.