红酒中酪蛋白过敏原检测方案(液相色谱仪)

分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第41卷2013年10月第10期1493~1498 分析化学第41卷1494 (Received 14 May 2013； accepted 29 June 2013) DOI： 10.3724/SP.J. 1096.2013.30449 交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理方法结合液相色谱-串联质谱分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原 张伟 贺艳?刘伟2吴智渊1 江峥 许泓弘王勇为' 张裕君” 郑文杰*2 (赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海201206)2(天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461) 摘 要 建立了红葡萄酒酪蛋白过敏原的质谱分析方法。选择专一性 SRM 离子对，建立3种亚型酪蛋白αx-S1， α-S2， β的质谱定性与定量方法；利用交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)处理红葡萄酒有效提取蛋白，并直接快速酶解，使前处理缩短到2h 以内。结果表明，酪蛋白的回收率提高到80%以上，检出限达 10 pg/L. 关键词 红葡萄酒；酪蛋白；过敏原；前处理；液相色谱-串联质谱 引 言 引起过敏的物质称为过敏原，一般为蛋白质类物质。随着食物过敏患者的增多，以及可能导致过敏性休克甚至死亡等严重后果，已建立了一系列针对过敏原的法规及检测方法，包括核酸法(PCR)和酶联免疫法(ELISA)等。新兴的质谱法(MS)灵敏度高、假阳性概率低，并具有方法开发快速、运行成本低等优势。 葡萄酒酿造过程中需要加入澄清剂去除沉淀物质，使酒液获得长期稳定性。酪蛋白是常用的澄清剂之一。酪蛋白是一种来源于牛乳的过敏原，残留在葡萄酒中会对过敏人群产生危害。但是葡萄酒，特别是红葡萄酒含有大量单宁等鞣质，单宁与蛋白质之间存在多点疏水键和氢键的作用，有很强的蛋白结合能力。单宁常用作酶抑制剂使酶失活。单宁极大地抑制了葡萄酒蛋白的提取与酶解，传统蛋白提取方法(超滤、透析、有机溶剂沉淀等)用于葡萄酒时回收率只有20%~30%1.21。因此，关于葡萄酒过敏原质谱分析的报道很少，研究对象也集中在单宁含量很低的白葡萄酒，对于含有大量单宁的红葡萄酒的前处理和质谱分析仍无成熟的策略[3.4]。已报道的方法如十二烷基硫酸钾(KDS)法、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)法等，提取后蛋白仍需要电泳去除单宁和两性电解质，工作量大，分析通量低，蛋白质的回收率很低15，6J 交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是 PVP 交联后形成的颗粒(约110 um)，具有很强的吸附能力7。PVPP 竞争性地与单宁结合，释放蛋白，可以有效去除单宁等多酚类物质[8，9]。本研究利用 PVPP 建立了快速、高效的红葡萄酒蛋白提取与酶解方法，使前处理时间缩短到2h之内，回收率达到80%以上。将本方法与三重四极杆液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)结合，分析了红酒中3种亚型的酪蛋白，检出限达到10 pg/L，比目前报道的方法提高了至少一个数量级3。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 TSQ Vantage 三重四极杆质谱、Ultimate 3000 超高效液相色谱(Thermo 公司)。α-酪蛋白(α-Casein)、-酪蛋白(B-Casein)、胰蛋白酶(Trypsin)、PVPP、NH HCO， 购自 Sigma-Aldrich 公司；乙腈、甲酸购自 Fisher 公司；红葡萄酒商品若干。 2.2 蛋白提取与酶解 样品制备：取红酒200 uL与酪蛋白混合溶液4uL(α-酪蛋白、3-酪蛋白各5 ug/L)充分混匀后(添 ( 2013-05-14收稿；2013-06-29接受 ) ( 本文系国家质检总局科技计划项目(No.2013IK183)资助 ) ( * E-mail： z h engwj@tjc i q. gov. cn ) 加量为100 pg/L时)，加入200 pL PVPP混悬液(100 g/L，溶于0.5 mol/L NH，HCO， 溶液)，并于30℃振荡反应 15 min。反应后，直接加入2 uL Trypsin (200 pg/L)，并于37℃振荡酶解1.5 h。 酶解完成后，于20000g离心5 min，取上清液。沉淀加入100 uL水，振荡超声2 min， 再于20000g下离心5 min，将溶液完全取出。两次溶液合并后，再次20000 g离心，取上清液直接进样分析。 对照品制备：第一步不加酪蛋白，前处理完成后、进样前，再加人 Trypsin 酶解后的酪蛋白混合溶液4 uL(α-酪蛋白、3-酪蛋白各5 mg/L ，添加量为100 pg/L)，混匀后直接进样分析。 2.3 LC-MS/MS分析 色谱条件：Hypersil GOLD aQ 色谱柱(100 mmx2.1 mm， 1.9 pm)；上样量：10pL； A 相：0.1%甲酸溶液；B相：0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：300 uL/min；分析梯度：0~2min， 5% B； 2~12 min， 5%~95% B； 12~17 min， 95% B， 17~18 min， 95%~5% B； 18~23 min， 5% B。 质谱条件：扫描模式： SRM，正离子；喷雾电压：3000V；气化温度：300℃；鞘气压：206.85 kPa；辅助气压( Arbitrary units)：10；离子传输管温度：350℃；碰撞气体(Ar)：0.20 Pa (1.5 mTorr)； Q1/Q3分辨率(FWHM)：0.7；驻留时间：0.04s；离子对及碰撞能量见表1。 2.4 数据处理 酪蛋白亚型序列来自 Swiss-Prot 数据库；专一性肽段与特征性碎片选择及碰撞能量优化由 PinPoint软件(Thermo)分析，结合 LTQ-Orbitrap 高分辨质谱(Thermo)全扫描确证获得；质谱数据由 XcaliburQual Browser 软件(Thermo)进行定性分析，由 Xcalibur Quan Browser 软件(Thermo)进行定量分析。 3 结果与讨论 3.1 酪蛋白LC-MS/MS 方法建立 酪蛋白有α和β两种主要亚型，其中α包含 S1 和S2 两种亚型。由于 α-S1， α-S2 和β三者序列完全不同，并同时具有致敏性，因此同时针对这3种酪蛋白建立 LC-MS/MS 分析方法。根据 Pinpoint 软件分析，从3种酪蛋白中分别选择两条特征性肽段，每条特征性肽段分别选择两个子离子，即每种亚型对应4对离子对，并获得相应的优化碰撞能量(表1)。为了确定离子对选择的准确性，进一步通过 LTQ-Orbitrap高分辨质谱对酪蛋白酶解产物进行了数据依赖性扫描分析，验证了离子对选择的合理性(图1)。 表1 酪蛋白特征性肽段及SRM 离子对选择 Table 1 Unique peptides of casein and design of selective reaction monitoring (SRM) transitions 亚型 特征性肽段 母离子 子离子 碰撞能量 Subtype Unique Peptide Precursor Ion (m/z， 2*) Product Ion (m/z， 1*) Collision Energy(eV) B-Casein AVPYPQR 415.73 400.23 660.35 17 VLPVPQK 390.75 372.22 568.35 16 a S1-Casein YLGYLEQLLR 634.36 771.47 991.56 24 FFVAPFPEVFGK 692.87 676.37 920.49 26 a S2-Casein ALNEINQFYQK 684.35 827.40 940.49 26 FALPQYLK 490.28 423.26 648.37 19 10r 图1 α S1-酪蛋白 YLGYLEQLLR 肽段 MS/MS 谱图 Fig.1 MS/MS spectrum of peptide YLGYLEQLLR from a S1-Casein α-S1和 α-S2 实际分度分别为8和2mg/L。相比PCR 和 ELISA 检测， LC-MS/MS 不仅能直接对目标过敏原进行鉴定，还可以同时分析不同亚型，方法的选择性、准确度、通量均有很大提高。 3.2 红葡萄酒快速前处理 利用 PVPP 实现了红葡萄酒高效、快速前处理，并最大程度地降低了蛋白的损失。向红酒中加入足量的PVPP 竞争性吸附单宁，再加入过量的 Trypsin快速酶解蛋白，离心取上清液，并重复一次，合并两次上清液后直接进行质谱分析(图3)。与传统方法相比，PVPP法不仅使回收率明显提高，也使前处理时间由12h(过夜酶解)缩短到2h之内。 PVPP 添加量是影响前处理效率和回收率的关键因素。在酪蛋白添加200pL 1 mg/L的红酒基质 100r 图2 酪蛋白特征性肽段 SRM 总离子流图(TIC)与提取离子流图(XIC) Fig.2 SRM total ion chromatogram and extracted ionchromatogram of casein unique peptides 图3 PVPP处理红葡萄酒的原理与流程 Fig. 3 Mechanism and workflow of polyvinylpyrrolidone (PVPP) pre-treatment of red wine 中，平行加入不同体积的100 mg/mL PVPP 混悬液，前处理完成后分别进行质谱分析，比较总离子流强度(图4)。结果表明，在 PVPP 混悬液加入量为200 uL，即绝对量为20 mg时，响应最高，由此确定20 mg PVPP/200 uL 红酒为最优添加量。 值得注意的是， PVPP添加量与处理效果并不完全成正比，当超过最优添加量时，质谱响应反而下降，处理效果变差。这可能与 PVPP 的比表面积和吸附力有关：达到最优添加量之前， PVPP 在红酒中均匀分散成小颗粒，比表面积大、吸附力强，有利于酚类物质吸附；当添加量超过最优值后， PVPP颗粒之间快速团聚形成沉淀，吸附能力下降，同时蛋白也随酚类物质掺杂在沉淀中，难以有效释放。因此，合适的 PVPP 添加量对前处理非常重要。 考察了 PVPP 法的基质效应，200 pL 红酒经PVPP 处理并添加酪蛋白(1mg/L)后质谱分析，并与 图4 PVPP 添加量对红酒中酪蛋白特征肽段 SRM 总离子流强度的影响(n=3) Fig.4 Effect of PVPP addition on total ion chromatogramintensity of casein in red wine(n=3) 等量经 PVPP 处理的空白红酒基质进行比较。结果表明(图5)，基质对肽段的质谱响应影响不大(峰面积差异小)，空白基质未见特征肽段的质谱响应。证明基质效应对检测无影响，前处理方法可靠、有效。 酪蛋白酶解产物 酪蛋白酶解产物+前处理后红洒基质 t/min 图5 红酒基质效应考察 Fig.5Effect of red wine matrix on casein analysis 3.3 多方法的回收率比较 红酒经 PVPP 处理后，酪蛋白(1mg/L， 1 ppm)回收率达到70%以上(图6)。而同样条件下，传统方法的回收率很低，丙酮沉淀法回收率为10%~25%，超滤法回收率低于1%(图6)。丙酮沉淀法与超滤法是蛋白样品前处理的经典方法，但由于红酒中存在大量单宁，抑制了蛋白的提取与酶解。PVPP有效解决了这一难题。 表2PVPP处理0.1 mg/L 红酒酪蛋白的回收率及重现性(n=4) 在低浓度下，PVPP 法同样能达到较高回收率。如表2所示，在 0. 1 mg/L酪蛋白(100 pg/L)添加量下，特征性肽段的回收率均可达到75%以上，肽段 ALNEINQFYQK 由于响应太低，无法准确计算回收率。 Table 2Recovery and reproducibility of PVPP method for caseinin red wine (n=4) 考察了0.1 mg/L酪蛋白在4种不同品牌红酒中的回收率。如表3所示，特征性肽段的回收率均保持在64%~150%之间，进一步证明了PVPP用于红酒酪蛋白快速前处理方法高效、可行。 亚型 特征性肽段 回收率 RSD Subtype Unique Peptide Recovery (%) (%) B-Casein AVPYPQR 79.2 2.8 VLPVPQK 88.7 3.0 a S1-Casein YLGYLEQLLR 79.2 3.1 FFVAPFPEVFGK 77.5 4.3 a S2-Casein FALPQYLK 82.6 7.9 ALNEINQFYQK N/A N/A 表3不同品牌红酒经 PVPP 处理后的回收率考察(n=4) Table 3 Efficiency of PVPP method for casein in different red wines (n=4) 红葡萄酒 最低回收率 最高回收率 最低 RSD 最高 RSD Red wine Min. Recovery Max. Recovery Min. RSD Max. RSD CC-001 77.5 88.7 2.8 7.9 ZY-003 94.2 149.9 5.7 8.2 WC-002 92.1 125.1 1.5 10.2 JKS-001 64.0 87.7 1.9 8.8 3.4 方法的线性、灵敏度考察 图6 红酒酪蛋白前处理方法的回收率比较：上图为β-酪蛋白 VLPVPQK 肽段不同处理方法的 LC-MS/MS 色谱峰对比；下图为6条肽段的回收率对比(n=6) Fig.6 Recovery comparison of different pre-treatment methods for casein in red wine. Comparison of LC-MS/MSchromatographic peaks of B-casein peptide VLPVPQK (up figures)； Comparison of recovery of 6 peptides (lowerfigures)(n=6) 稀释为 0.01 ~50 mg/L 的12个浓度点，分别质谱分析并绘制标准曲线。图7展示了β-酪蛋白 VLPVPQK肽段的标准曲线，在3~4个数量级范围内，该肽段具有良好的线性(R’=0.9996)和重现性(RSD<6%)。表4总结了3种亚型酪蛋白共6条肽段的线性范围，在0.01~50 mg/L浓度范围内，相关系数R²>0.99，显示出良好的线性。 图7 红酒中β-酪蛋白 VLPVPQK 肽段的线性范围(PVPP法)(n=4) Fig.7 Linear response range of peptide VLPVPQK fromB-casein in red wine (PVPP method)(n=4) 酪蛋白浓度 Casein concentration(mg/L) 表4 PVPP 法的线性范围与定量限 Table 4 Linear response ranges and limits of quantification (LOQs) of PVPP method 亚型 特征性肽段 线性范围 定量限 线性回归方程 相关系数 Correlation Subtype Unique peptide Linear response range (mg/L) LOQs (ug/L) Linear regressive equation coefficient (R²) B-Casein AVPYPQR 0.05~50 50 Y=16231500X-225844 0.9998 VLPVPQK 0.01~50 10 Y=41741400X-95857.7 0.9996 α S1-Casein YLGYLEQLLR 0.10~50 ~80 Y=22720000X-2104530 0.9990 FFVAPFPEVFGK 0.05~50 ~40 Y=16411400X-713329 0.9969 a S2-Casein ALNEINQFYQK 0.50~50 ~100 Y=409249X+14713.5 0.9922 FALPQYLK 0.20~50 ~40 Y=2813760X-38746.1 0.9964 根据αx-酪蛋白中 α-S1 和 αx-S2所占比例计算，最终确定6条肽段的定量限在10~100ug/L 之间， 对应到 α-S1， αx-S2 和β-酪蛋白的定量限分别为40， 40 和10 pg/L(表4)，比文献[3]报道方法提高约一个数量级。此外，在10 pg/L浓度下，所有肽段均有响应(信噪比>3)，因此α-S1， α-S2，β-酪蛋白的检测限均在10 pg/L以下，同样比文献[3]报道方法提高约一个数量级。 4 结j论 通过 PVPP 快速前处理，使红酒中酪蛋白回收率提高到80%以上，使整个前处理时间缩短到2h之内，有效解决了红酒中大量单宁对蛋白提取与酶解的抑制。将 PVPP 法与三重四极杆液相色谱-质谱结合，分析了红酒中3种亚型的酪蛋白α-S1，α-S2，β的过敏原，检测限均低至10 ug/L，定量限达 10 ~40 uug/L，同时结果具有良好的重现性。PVPP 前处理方法简单有效、重现性好，适用于高通量的红葡萄酒过敏原检测。 ( Reference ) ( Oh H I ， Hoff J E ， A rmstrong G S， Haff L A. 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Proteomics，2010，73(12)：2 3 70-2377 ) Rapid Polyvinylpolypyrrolidone Pretreatment Approach for LiquidChromatography Tandem Mass Spectrometric Analysis ofCasein Allergen in Red Wine ZHANG Wei， HE Yan’， LIU Wei， WU Zhi-Yuan'， JIANG Zheng， XU Hong， WANG Yong-Wei'， ZHANG Yu-Jun²， ZHENG Wen-Jie *2 (ThermoFisher Scientific China， Shanghai 201206， China) (Animal & Plant & Foodstuffs Inspection Center， Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Tianjin 300461， China) Abstract AMS method for casein allergen analysis was developed to reduce the restriction of proteinextraction and digestion from tannins in red wine. Unique selective reaction monitoring (SRM) transitionswere selected and confirmed for qualitative and quantitative detection of a-S1， a-S2 and B-caseins. Effectiveextraction and fast digestion of red wine protein were realized by utilizing polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)，which also reduced the pre-treatment time within 2 h. Results showed that the PVPP method increased redwine Casein recovery toat least 80%. Simultaneously， the limits of detection decreased to 10 ug/L， and thelimits of quantification to 10-100 ug/L， which lowered at least one order of magnitude compared to previousreports. Keywords Red wine； Casein； Allergen； Pretreatment； Liquid chromatography tandem mass spectrometry