葡萄酒中综合检测方案(紫外分光光度)

应 用 文 章 葡萄酒的颜色强度和色调 版权所有 C2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 UV/Visible Spectroscopy 作者 Steve UpstonePerkinElmer，Inc.Seer GreenBucks HP9 2FX，UK 使用Lambda系列分光光度计对葡萄酒进行分析 序言 使用传统的方法生产葡萄酒已经有8000多年的历史了。最近几年，在生产上世界各地仍然有增长趋势，大多数来 自“新型世界”的葡萄酒生产商，比如美 国(尤其是加利福尼亚洲)、澳大利亚、新西兰、南非和一些南美洲国家-特别是阿根廷和智利。像英国和加拿大，即使不太可能成为葡萄酒的生产地，仍然生产出相对少量的高质量葡萄酒。这种生产地理位置的扩大同样导致了生产技术的提高，这种技术包括制造和检测技术以保证葡萄酒口感的一致性和质量安全。现代分析技术通常被大型生产商所使用，比如气相色谱和液相色谱。另一种技术 就是紫外-可见光谱。 葡萄酒质量的一个指标就是它的颜色。早先时候，，一一般通过眼睛来判断葡萄酒的颜色，但是这种方法最多算是半定量分析。使用仪器法对于葡萄酒颜色的数量分布是一个很有用的方法。尽管颜色仅仅是一个主要的质量元素，但是它能够帮助我们分析安全问题，因为葡萄酒颜色的改变能够预示我们有可能酿造程序出现错误，或者是有细菌和其它的污染物。 一种最简单的方法就是测量葡萄酒在可见光区中三个波长下的吸光度。一般情况下是420nm、520nm和620nm。通过这些能够总结出葡萄酒的颜色强度，计算A420/A520的比例可以判断出葡萄酒的色调。这些计算都是基于葡萄酒在10mm光程吸收池中的吸收度。至于红葡萄酒，为了使得到的光谱在仪器的测量范围内，必须使用更短光程的吸收池(比如1mm)。所得到的数值可以重新换算成1cm吸收池的数值。 这种简单的方法已经被接受，因为这种方法可以使用比较简单的仪器设备进行测试，该仪器并不需要具备全波长段扫描功能。 基于CIE的颜色分析 一个更准确的方法使利用380nm-780nm整个可见光谱区域，并应用CIE(总部位于维也纳的D'Eclairage国际委员会)开发的标准比色方法。CIE是个国际机构，主要负责这个区域的颜色代表数值。它的第一个操作规格于1931年发布，并且在过去几年一直在稳步发展。颜色的计算是一个加权透过率值，该值考虑了照明条件和光谱对眼睛响应光的三原色(红光、绿光和蓝光)。同时，它还考虑了在视网膜上两种类型的颜色受体，视杆细胞(主要是在低光条件下的单色视觉)和视锥细胞(主要是在相对良好的照明条件下工作的颜色受体)。 葡萄酒分析通常采用1964年的计算方法。这种计算方法采用10°的观测者角度(这个既考虑到视杆细胞的贡献又考虑到视锥细胞的贡献，而早些时候1931年的2°标准角度只是偏向于视锥细胞)和D65光源照明(日光色温为6500K)。这种计算方法得出红光、绿光和蓝光三原色的值，这些三色值中，X代表红色、Y代表绿色、Z代表蓝色。这种计算涉及到调整吸光度扫描值使其相当于1cm光程，然后将调整后的吸光度值转换为透过率值(%T)。CIE发布光源的权重表以及红光、绿光、蓝光对眼睛反应的权重表。具体计算公式如下所示： 其中，S(入)代表D65光源的相对光谱功率分布，根据CIE提供 X10yo和z代表10°观测者角度的颜色匹配函数，根据1964年的CIE提供 R()代表样品的反射光谱 这些值可以规范化，结果是x+y+z=1。这就意味着z值不需要进行计算，因为它是隐含的，所以一种颜色可以使用x值和y值来进行描述。 当使用这个系统引用一种颜色，它通常会包含非标准化的Y值。x和y值可以绘制出来相互产生一张图，这张图叫做CIE颜色空间图。 图1.CIE颜色空间图 这张图能够代表任何可能的颜色(不可能的颜色在颜色之外的区域)。在图中中间有块区域称为白色点。 1976年，CIE颁布了另一个更为细化的颜色测量系统，这就是L* a* b*系统。该系统基本上是一种代表颜色在三维空间的卡迪尔坐标，转换成L* a*b*值如下所示(Xn、Yn和Zn代表在白色点的X、Y、Z值，对于10°的观测者角度数值分别是94.811、100和107.304)。 如果X/Xn、Y/Yn或者Z/Zn有一项小于0.008856，那么有·有一个特殊的方程，在这种情况下计算方法应变为： 如下图所示，L* a* b*值可以在三维空间中表示： 图2.L*a*b*颜色空间 该计算方法的最后一部分就是计算色度(C*ab) 和色彩角(h*ab)。这些都是从卡迪尔坐标到极坐标L* a* b*值的转换，这个也称作L*C*h*颜色空间。 L*与L* a* b*颜色空间中L*值一样。 葡萄酒生产业也使用这些值来得出出些基于L*k a*b*和C*ab值的额外参数。这些值包括： 实验部分 葡萄酒样品的数据测试使用Lambda25，35或者45搭配一个标准的石英吸收池。吸收池的光程取决于所测试葡萄酒样品的类型。对于酒体饱满的红葡萄酒，通常使用1mm吸收池。对于干白葡萄酒，10mm光程的吸收池是最合适的。仪器需要使用蒸馏水空白进行自动调零，蒸馏水盛放在与测试样品一样的光程的吸收池中。对于短光程的吸收池，推荐使用一个合适的垫片。 在葡萄酒分析方法中进行测试操作，该分析方法作为一个例子方法提供在UV WinLab6版本的软件中。 表1.吸收池和垫片的货号 货号描述 B0631025 1mm光程石英吸收池带PTFE塞子(2个装) B0631008 5mm光程石英吸收池带PTFE盖子(2个装) B0631009 10mm光程石英吸收池带PTFE盖子(2个装) N9302471 1mm光程吸收池垫片(2个装) N9302743 5mm光程吸收池垫片(2个装) UVWinLab 6版本软件和LAMBDA20，40， 25， 35，45，650，750，800，850，900和950仪器都能兼容。该方法程序设计与中端仪器一起使用 (LAMBDA模型和两位数的数字，如LAMBDA225)，但是数据能够导入到以上所列出所有仪器的方法中。 使用带有UV WinLab 6.0版本软件的Lambda 25分光光度计分析不同类型的葡萄酒，结果见下表所示。 根据葡萄酒的口感和欣赏，葡萄酒可分为下面标题几类。这些分类来自于西班牙的出版物，分类受主观影响，并且会随着国家的不同略有不同。 柔和的淡黄色：带有酒精含量的一种非常新型且清淡的酒。这种颜色还能够显示出葡萄酒的缺陷，要么是经过过度的过滤，要么是使用过太多的净化剂。 带有绿色色调的淡黄色：因为有叶绿素的存在，这是一种带有绿色倒影的非常白葡萄酒。该葡萄酒往往保留有葡萄的绿色色素。 淡黄色：特指在高峰成熟的白葡萄酒。 金黄色：表明该白萄酒正在老化和氧化。 琥珀黄：典型地由部分干葡萄或者强化葡萄制成的葡萄酒。当淡黄色的葡萄酒变成这种颜色，该葡萄酒由于氧化正在变质。 粉红色：带有红色和轻软倒影的葡萄酒。 浅桃红：带有柔和红色几乎是透明的葡萄酒。 樱桃红：每公升不超过100mg花青素(能够产生蓝色并变成红色的植物色素)的葡萄酒，并且该葡萄酒通过长期的浸皮制成。 紫红色：向玻璃瓶边缘有紫色倒影的红葡萄酒。 宝石红：描述在成熟早期阶段的一种健康的红葡萄酒。 石榴红：带有一种显著结构和勃艮第颜色的典型成熟红葡萄酒。 红褐色：在它们主要的成熟期，在玻璃瓶边缘带有温暖橘黄色的葡萄酒。 使用L* a* b*值和一个已知的标准或者理想值，通过计算△E值，还可以得出色差。计算公式如下所示： △E值虽然假设颜色空间是统一的(实际上不是)，但是仍然广泛的用于葡萄酒工业，并且对那种较小的颜色差别非常有帮助，正如在这类分析中所预期的那样。 为了达到识别的目的，使用L* a*kb*颜色数据分析个别色素是有可能的。像一些色素，比如氯化锦葵色素当达到一定的酸度值会展现出很大的颜色差异。然而其蛇的一些色素，比如乙烯基邻苯二酚吡喃酮花青素则几乎保持不变。 图3.L*a*b*颜色值分析个别色素 表2.使用Lambda 25对葡萄酒进行分析 葡萄酒类型 类型 颜色 颜色 Y X L* a* b* C*ab h*ab S* Q* 强度 色调 南非未经陈酿的白诗南 带有绿色色调的淡黄色 0.1045 4.0241 91.12 96.42 95.94 0.3214 0.3401 98.60 -0.53 4.91 4.94 96.14 0.05 118.74 基于紫外-可见分光光度计的其它葡萄酒试验 280nm处的吸光度 对于所有吸收在280nm附近的酚类物质来说，由于它们的芳香本性，这是一个具有非特异的试验。其简单被反驳的事实是它将测量其它的芳香族化合物(比如核酸和芳香多肽及蛋白质)，并且这种测试不会区分不同类型酚类物质。这种测试需要分光光度计具备紫外区的测试能力(比如320nm以下)。 对于酚类物质的福林酚试验 这个测试能够用来测量酚类化合物是基于酚类化合物在碱性条件下能够完全离子化，因此能够很容易的被福林酚试剂所氧化。这种氧化会导致颜色由黄色变为蓝色，很容易在765nm处用紫外-可见分光光度计测量。福林酚试剂具有很强的还原性能够氧化葡萄酒中其它组分，比如果糖、抗坏血酸、亚硫酸盐和氨基酸。这个可以通过加入乙醛来阻止它，乙醛可以和亚硫酸盐结合，或者对于甜葡萄酒，我们可以通过校正系数进行校正。 对于酚类物质的酶方法 最近涉及到辣根过氧化物酶的方法已经被介绍可作为福林酚试验的替代法。它是将酚类物质转换成亚胺奎宁，该实验非常迅速，在5分钟内即可完成。该方法仍在发展并没有被证明可以很好地处理所有类型的酚类物质。 多羟基酚类物质的氯化铁试验 氯化铁会与含有多个羟基(至少两个)官能团的特定酚类物质结合，因此葡萄酒中所有的酚类物质都会被检测到，除了花青素和其蛇单羟基酚类物质。 丹宁酸试验 对于葡萄酒中丹宁酸的检测主要有三种试验方法，分别是Glories明胶指数、Llaudy方法和UC Davis试验。这三种方法都是基于单宁酸被蛋白质所沉淀，并随着样品的复杂程度而改变。Glories试验使用明胶作为蛋白质，需要忍受沉淀步骤非常长的事实。Llaudy方法使用卵清蛋白，比Glories方法具有更好的重复性，但是对于每一个葡萄酒样品需要总共12次的测试。UCDavis试验使用牛血清白蛋白作为沉淀剂。然后，这些物质与氯化铁反应并在510nm处进行测试。 亚硫酸盐和乙醇的酶检测 作为色谱分析法的替代方法，通过使用德国拜发(罗氏药厂的一个部门)所售的一些试剂盒可以检测出葡萄酒中的一些分析物，比如亚硫酸盐和乙醇。对于乙醇，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 和乙醇脱氢酶存在的情况下，乙醇被氧化成乙醛，该试验设计在20℃下进行。对于亚硫酸盐，要进行两个阶段反应。第一阶段涉及到亚硫酸盐氧化酶(SO2-OD) 氧化亚硫酸盐。这个反应的产物是过氧化氢，然后再NADH过氧化物酶(NADH-POD)存在的情况下与NAD+进行反应。 对于葡萄酒检测的其他有用分析技术 对于比较繁忙的实验室，样品处理量是一个非常重要的因素，包括气相和液相色谱在内的分析技术需要被考虑。顶空进样气相色谱尤其有用，因为它可以对易挥发的组分进行快速分析，比如葡萄酒中的乙醇。对于金属元素的分析，比如铜，原子吸收(AA) 和电感耦合等离子体光谱 (ICP)等仪器应当被考虑。 结论 Lambda25，35，45能够提供一个准确且简单的方法来得到葡萄酒的高质量谱图，并且能够自动计算出所需的参数，不需要另外导出电子数据表格和外部程序。双光束光路设计和低的杂散光保证了测试高颜色葡萄酒样品的出色性能，灵活的报告设计模板允许定制报告满足内部和外部客户的需求。 我们已经记录了UVWinLab软件方法计算的处理链，可以对其编辑和检查。我们所提供的方法可随时运行，不需要进行修改和校正。 Table 3. UV WinLab method calculation processing chain. ( Birse， M ， Pollnitz， A， Herderich， M CIE L ab Colour Values： E nhancedWine Colour Measurement for Use by the Wine Industry and inResearch Applications， P o ster by the Australian Wine Institute，Adelaide， Cooperative Research Centre for Viticulture， School ofAgriculture and Wine， U n iversity of Adelaide. ) Singleton VL， Orthofer R， Lamuela-Raventos RM. Analysis of totalphenols and other oxidation substrates and antioxidants by meansof Folin-Ciocalteu reagent. Meth Enzymol 1999；99： 152-178. Harbertson， J.F.， Picciotto， E. A.， and Adams， D.O. Measurementof Polymeric Pigments in Grape Berry Extract sand Wines Using aProtein Precipitation Assay Combined with Bisulfite Bleaching， Am.J.Enol. Vitic. 54：4：301-306 (2003) r-Biopharm Kit. 珀金埃尔默仪器(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区区衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs 使用传统的方法生产葡萄酒已经有8000多年的历史了。最近几年，在生产上世界各地仍然有增长趋势，大多数来自“新型世界”的葡萄酒生产商，比如美国（尤其是加利福尼亚洲）、澳大利亚、新西兰、南非和一些南美洲国家-特别是阿根廷和智利。像英国和加拿大，即使不太可能成为葡萄酒的生产地，仍然生产出相对少量的高质量葡萄酒。这种生产地理位置的扩大同样导致了生产技术的提高，这种技术包括制造和检测技术以保证葡萄酒口感的一致性和质量安全。现代分析技术通常被大型生产商所使用，比如气相色谱和液相色谱。另一种技术就是紫外-可见光谱。葡萄酒质量的一个指标就是它的颜色。早先时候，一般通过眼睛来判断葡萄酒的颜色，但是这种方法最多算是半定量分析。使用仪器法对于葡萄酒颜色的数量分布是一个很有用的方法。尽管颜色仅仅是一个主要的质量元素，但是它能够帮助我们分析安全问题，因为葡萄酒颜色的改变能够预示我们有可能酿造程序出现错误，或者是有细菌和其它的污染物。