亳菊中木犀草素及芹菜素的含量检测方案(液相色谱柱)

时珍国医国药2009年第20卷第7期北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2009VOL.20 NO.7 北京豫维科技有限公司联系人：水先生自电话：18911849923LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2009 VOL.20 NO.7 时珍国医国药2009年第20卷第7期 反相高效液相色谱法测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量 潘 见，汪 翔，杨 毅，金日生 (合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009) 摘要：目的建立同时测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的反相高效液相色谱检测方法。方法采用 Restek PinnacleⅡ Cs(250 mm×4.6 mm，5 um)色谱柱，配制流动相为甲醇：四氢呋喃：0.3%H，PO 水溶液=42：13：56，在流速为1.0 ml/min，检测波长为350 nm，柱温为室温，进样量为10 ul的情况下建立测定方法。结果木犀草素线性范围为3.99~99.75 pg/ml(r=0.999 6)，平均加样回收率为 105.9% ，RSD=1.5%；芹菜素线性范围为4.095~102.375 pg/ml(r=0.999 6)，平均加样回收率为103.7%，RSD=2.5%。结论用该方法测定毫菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量，具有分析时间较短，分离度高的特点。 关键词：反相高效液相色谱法； 木犀草素； 芹菜素； 亳菊提取物 中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1008-0805(2009)07-1576-02 Determination of Luteolin and Apigenin in Chrysanthemum morifolium Extract by RP-HPLC PAN Jian， WANG Xiang， YANG Yi， JIN Ri-sheng (Engineering Research Center of Bio - process of Ministry of Education， Hefei University of Technology， Hefei230009，China) Abstract：Objective To develop a reversed -phase high performance liquid chromatographic method for the simultaneous deter-mination of luteolin and apigenin in Chrysanthemum morifolium extraet. Methods The separation was carried out on a Restek Pin-nacle Ⅱ Cs column(250 mm×4.6 mm，5 um) with MeOH： THF： 0.3%H PO=42： 13： 56 as mobile phase at a flow rate of1.0 ml/min. The absorbance was monitored at 350 nm. The volume of injection was 10 u.1. Results The linearity was good withinthe ranges of 3.99 pg/ml~99.75 ug/ml(r=0.999 6) for luteolin and 4.095 pg/ml~102.375 pg/ml(r=0.999 6)for apige-nin. The average recoveries were 105.9% and 103.7% and the relative standard deviations(RSDs) were 1.5% and 2.5% respec-tively. Conclusion The method used for the determination of luteolin and apigenin in the Chrysanthemum morifolium extract hasthe characteristics of short retention and high resolution. Key words：RP-HPLC； Luteolin： Apigenin； Chrysanthemum morifolium extract 中药菊花是菊科植物菜 Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序11，是一种常用中药，具有疏风、清热、明目、解毒功效，临床上用于治疗高血压病和冠心病等2。毫菊主产于安徽亳州、涡阳一带3。菊花的有效部位主要有黄酮类、萜类、碳环芳香族酚酸类化合物(蒋惠娣.《中药杭白菊心血管系统作用及活性成分研究》.2004浙江大学博士学位论文)4]。毫菊提取物成分复杂，为控制其产品质量，依据菊花药效物质及药理作用，建议以绿原酸、木犀草素、芹菜素和总黄酮4个指标，构建质量评价体系。其中木犀草素具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降低兔实验性动脉粥样硬化程度和降胆固醇等作用14.5J；芹菜素具有抗肿瘤、抗炎、降血压和舒张血管、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌、抗病毒等作用6]。两者药理作用与毫菊的药理作用相近，且两者在毫菊提取物中含量较高。因此，建立同时测定木犀草素及芹菜素的 HPLC 测定方法，对菊菊提取物的质量标准研究及亳菊药材的质量控制具有重要的意义。 1 仪器与试药 Waters 高效液相系统(包括 Waters 515 泵，Waters 2487双波长紫外检测器， Empower 色谱工作站)；SC5202超声清洗器(上海蒲超超声波仪器设备有限公司)；AG135 型电子天平(Mettler To-ledo)。 ( 收稿日期：2008-10-17； 修订日期：2008-12-29 ) ( 基金项目：国家“十一五”科技支撑计划子课题(No.2006BAI06A14-05) ) ( 作者简介：潘 见(1955-)，男(汉族)，安徽金寨人，现任合肥工业大学教授，博士学位，主要从事天然产物分离纯化及天然药物的研发工作. ) 甲醇(色谱纯)；四氢呋喃(色谱纯)；超纯水；磷酸(分析纯)；木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111520-200504)；芹菜素对照品(上海融禾医药科技发展有限公司)；毫菊[Dendranthema. morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Boju'由安徽济人药业提供]；毫菊提取物样品(农产品生物化工教育部工程研究中心研究制备)。 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Restek Pinnacle Ⅱ C柱(250 mm ×4. 6mm，5 um)；流动相为甲醇：：四氢呋喃：0.3%H，PO4=42：13： 56；流速1.0 ml/min；检测波长350 nm；柱温为室温；进样量10ul， 2.2 对照品储备液的制备精密密取木犀草素、芹菜素对照品适量，用甲醇溶解配制成含木犀草素为399 pg/ml及芹菜素为409.5 pg/ml的对照品混合溶液。 2.3 供试品溶液的制备取毫菊提取物样品约75 mg，精密称定置小烧杯中，用10 ml甲醇超声溶解，转移至25 ml容量瓶中并定容摇匀，取部分溶液离心(10000 r/min，5 min)，取上清液即得供试品溶液。 2.4 标准曲线的绘制从对照品储备液中精密量取0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml，分别置于 10 ml 容量瓶中，甲醇定容，得到系列混合对照品溶液，各进样10 pl，按照上述的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度(pg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得木犀草素回归方程为Y=34778X-41 681(r=0.9996)，线性范围为3.99~99.75 ug/ml；芹菜素回归方程为Y=50 871X- ( 38 471(r=0.9996)，线性范围为 4.095~102.375 ug/ml。 ) 2.5 精密度实验取木犀草素、芹菜素混合对照品溶液(其中木犀草素为99.75 pg/ml，芹菜素为102.375pgml)重复进样5次，10ul/次，测量峰面积，其中木犀草素峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.93%，芹菜素峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.07%。 2.6 重复性实验按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，分别进样10 p.l，依照上述选择的色谱条件测定，结果木犀草素含量的 RSD 为1.83%，芹菜素含量的 RSD为2.08%。 2.7 稳定性实验按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，16 h分别进样10 pl，依照上述选择的色谱条件测定，结果木犀草素峰面积的 RSD 为2.26%，芹菜素峰面积的 RSD 为3.03%。 2.8 加样回收率实验 2.8.1 木犀草素加样回收率实验精密称取毫菊提取物约20 mg 置小烧杯中，加入木犀草素对照品，用5ml甲醇超声溶解，转移至10 ml容量瓶中并定容摇匀，取部分溶液离心(10000 r/min，5 min)，取上清液，进样10 pl，依照上述选择的色谱条件测定。结果见表1。 表1 毫菊提取物中木犀草素的加样回收率测定结果 样品中 对照品 实测 加样回收率 RSD 含量m/ug 加量m/ug 值m/ug (%) (%) 123.8 133 263.0 104.7 124.4 267.9 107.9 125.0 253.8 107.3 1.5 122.0 87.8 213.8 104.6 131.2 79.8 214.9 104.9 2.8.2 芹菜素加样回收率实验精密称取毫菊提取物约75 mg 置小烧杯中，加芹芹菜素对照品，用10ml甲醇超声溶解，转移至25 ml容量瓶中并定容摇匀，取部分溶液离心(10000 r/min，5 min)，取上清液，进样10ul，依照上述选择的色谱条件测定。结果见表2。 表2 毫菊提取物中芹菜素的加样回收率测定结果 样品中 对照品加人 实测 加样回收率 RSD 含量m/jug 量m/ug 值m/pg (%) (%) 819.9 612 1476 107.2 749.0 612 1366 100.8 807.9 612 1455 105.7 2.5 780.2 612 1409 102.7 799.7 612 1425 102.2 n=5 2.9 样品测定按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，依照上上选择的色谱条件，进样10 p.l，木犀草素和芹菜素的保留时间分别在11.3，15.6 min 左右。色谱图见图1。结果见表3. 1.木犀草素 2.芹菜素 图1 对照品(a)及样品(b)的色谱图(柱温：30℃) 3 讨论 3.1 检测指标的确定《中华人民共和国药典》菊花项下以绿原酸为质量控制指标，但仅用绿原酸难以反映菊花广泛的药理作用。毫菊中黄酮类化合物含量高，对心血管具有多种作用，所以黄酮类化合物含量宜列入质量控制指标。由于黄酮类成分比较复杂，一般以测总黄酮为考察指标(邢志霞.《怀菊花质量标准研究》.河南中医学院论文集.2006)。有效成分木犀草素及芹菜素是在亳菊中含量较高且药理作用与菊花相似的黄酮类单体成分，其含量的高低对于亳菊药材以及毫菊提取物的药效有着重要影响，所以在毫菊药材及其提取物质量检查时如同时控制绿原酸、总黄酮、木犀草素及芹菜素的含量则更佳。 表3 亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量测定 % 批号 木犀草素含量 芹菜素含量 20080403 0.400 0.896 20080407 0.406 0.872 20080412 0.423 0.946 20080418 0.390 1.080 20080610 0.541 1.040 3.2 流动相的选择文献资料基本是用甲醇磷酸水溶液作为流动相来测定木犀草素，但是在本研究过程中经过多次实验，发现分离效果对于流动相组成比例和温度变化很敏感，且分析时间长。多次实验结果表明，在等梯度的情况下，只用甲醇磷酸水溶液做流动相同时测定木犀草素及芹菜素，难以使两者达到较好检测水平。 流动相加入四氢呋喃后，发现黄酮苷元分离的选择性提高了。根据实验中色谱峰出峰规律，最终将甲醇：四氢呋喃： 0.3%H，PO=42：：56作为定量检测用的流动相。该色谱条件分析时间较短，木犀草素及芹菜素均有较佳的分离效果。柱温对分离效果有影响，在柱温为20，25，30℃条件下尝试测定，发现分离效果均较好。20，25，30℃在《中国药典》规定的室温(10~30℃)范围内，所以方法中定柱温为室温。图2为筛选流动相时候的分离效果图。 18.00 1.木犀草素 2.芹菜素 图2 不同流动相的分离效果图 可以看到流动相为甲醇： 0.2%H，PO，=50： 50时，木草草素及芹菜素分离效果均不好且时间长；流动相为甲醇：四氢呋喃： 0.3%H，PO=44： 7： 56时，芹菜素分离效果较好，而木犀草素峰周围有杂峰干扰；流动相为甲醇：四氢呋喃： 0.3%H，PO=44： 9： 56时，依旧芹菜素分离效果较好，此时与木犀草素相邻的干扰峰随着四氢呋喃量的增加，出峰渐快于木犀草素，继续加大四氢呋喃的量，在流动相为甲醇：四氢呋呋：0.3%H，PO =42： 13：56时，两者均有较好的分离效果且分析时间减 少了。 3.3 色谱柱的选择实验尝试运用本工程研究中心的三根十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱： Agilent Hypersil ODS(250 mm ×4.6 mm，5 um)， Restek Pinnacle DB C8(250 mm ×4.6 mm， 5um)和 Restek Pinnacle Ⅱ Cjg(250 mm×4.6 mm，5 p.m)，效果均较好，能达到基线分离，说明此流动相具有一定的通用性。通过比较，认为用 Restek Pinnacle I Ci8(250mm×4.6 mm，5um)效果更好。 用本方法可同步测定毫菊提取物中的木犀草素和芹菜素。方法具有分析时间较短，分离度高的特点。木犀草素和芹菜素的保留时间分别在11.3，15.6 min 左右；木犀草素线性范围为3.99~99.75 ug/ml(r=0.9996)，平均加样回收率为105.9% ，RSD=1.5%；芹菜素线性范围为4.095~102.375 ug/ml(r=0.9996)，平均加样回收率为103.7%，RSD=2.5%。 ( 参考文献： ) ( [1] ]国 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社， 2005. ) ( [2] 白 雁，鲍红娟，王东.不同产地药用菊花红外光谱法的分析与 鉴定[J].中 成 药，2006，28(12)：1721. ) ( [3] 顾瑶华，秦民坚.毫菊的化学成分研究[J].中草药，2006，37 (12)：1784. ) ( [4] 程宏英，冯启余，曹玉华.菊花中活性成分的高效液相色谱测定与指纹图谱研究[J].分析科学学报，2007，23(3)：257. ) ( [5] 李星霞，郭 澄.木犀草草的药理活性研究[J].中国药房，2007，18 (18)：1421. ) ( [6] 孙 斌，瞿伟菁，张晓玲.芹菜素的药理作用研究进展[J].中药材， 2004，27(7)：531. ) 两种 Ames 试验方法在蒲葵子提取物致突变试验中灵敏度的研究 黄 燕1，钟振国1*，罗沛 (1.广西中医学院基础医学院，广西南宁5530001： 2.广西中医学院药学院2005 及硕士研究生，广西南宁530001) 摘要：目的通过 Ames 试验与彷徨试验对蒲葵子正丁醇提取物的致突变试验结果，比较两种试验的灵敏度。方法对蒲葵子用正丁醇浸提，用Ames试验方法(掺入法)与彷徨试验方法，对 TA100 鼠伤寒沙门氏菌株进行致突变试验。结果两种试验方法结果显示，蒲葵子正丁醇提取物在5~500 ug/ml剂量范围，以Ames 试验方法与彷徨试验均检测出阳性结果，而在0.025 ug/ml 与0.5 ug/ml 剂量下，彷徨试验能检测出阳性结果，而 Ames 方法未检测出阳性结果。结论在较低浓度时，彷徨试验能检测出 Ames 试验检测不出的阳性结果，表明彷徨试验灵敏度较 Ames 试验高。 关键词：正丁醇提取物； Ames： 彷徨试验； 灵敏度 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1008-0805(2009)07-1578-02 A Sensibility Study of Two Ames Tests on Sudden Change Experiment of Chinese Fan -palm Extraction HUANG Yan'， ZHONG Zhen-guo*， LUO Pei (1. Faculty of Preclinical Medicine， Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 530001， China；2. 2005 Post Graduate， Faculty of Pharmacology， Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning530001， China) Abstract：Objective To compare the sensitivity of the Fluctuation test and Ames test for examination of the sudden changecaused by Chinese fan- palm sub - normal butyl alcohol extraction. Methods Chinese fan - palm was extracted with the normalbutyl alcohol， and Ames test and Fluctuation test were carried out to detect TA100 mouse salmonella typhimurium. Results Theresults demonstrated that the extract in the range of 5~500 ug/ml，the Ames test method and the fluctuation test method detectedthe positive result， and in the range of 0.025~0.5 ug/ml， the Fluctuation test could examine positive result， but the Ames testcould not change. Conclusion In low concentration， the Fluctuation test can examine positive result but Ames test can not， whichindicated that the Fluctuation test has higher sensitivity than the Ames test. Key words：Normal butyl alcohol extraction； Ames： Fluctuation test； Sensitivity ( 收稿日期：2008-07-23； 修订日期：2008-12-20 ) ( 基金项目：国家自然科学基金地区联合资助项目(No.30160095)；广西科技厅资助项目(桂科能05112001-3A1)； ) 广西高校人才小高地建设创新团队资助计划 ( 作者简介：黄 燕(1976-)，女(壮族)，广西马山人，现任广西中医学院基础医学院实验师，主要从事微生物研究工作. ) ( *通讯作者简介：钟振国(1956-)，男(汉族)，广西陆川人，现任广西中中学院基础医学院教授，博士学位，主要从事教学与中药新药的研究开发工作. ) 利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。彷徨试验也是一种细菌回复突变试验，根据营养缺陷型菌株与受试化学物温育后在缺乏相应营养物的培养液中的生长情况判断所试化学物的诱变活性，节省试验材料(辅酶Ⅰ其需 Ames 平板掺人法用量的20%)。实验结果表明， Ames 试验结果与动物致突变性有90%的相符率，而彷徨试验对于弱的、具有细胞毒性和低浓度的诱变/致突变物的检测有其优超性。因此这些方法是较好的化学物质诱变活性评价的试验方法。 ·网址：： www.yuweichina.com 邮箱watercom 反相高效液相色谱法测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量目的建立同时测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的反相高效液相色谱检测方法。方法采用Restek PinnacleⅡC18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,配制流动相为甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4水溶液=42∶13∶56,在流速为1.0ml/min,检测波长为350nm,柱温为室温,进样量为10μl的情况下建立测定方法。结果木犀草素线性范围为3.99~99.75μg/ml(r=0.9996),平均加样回收率为105.9%,RSD=1.5%;芹菜素线性范围为4.095~102.375μg/ml(r=0.9996),平均加样回收率为103.7%,RSD=2.5%。结论用该方法测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量,具有分析时间较短,分离度高的特点。