猪肉中β受体激动剂检测方案(生化耗材)

应用文集 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 固相萃取净化以及三重串联四极杆液质联用仪用于猪肉中β2-受体激动剂的检测 作者 摘要 Andy Zhai 安捷伦科技有限公司 英伦路412号 外高桥保税区 上海，200131 中国 建立了一种同时分析猪肉中11种G2受体激动剂残留——克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴多、特布他林、沙美特罗、普萘洛尔、妥洛特罗、西马特罗、马布特罗、马喷特罗和齐帕特罗的方法，并对方法进行了验证。样品中的待测物用液-液萃取(LLE)和固相萃取 (SPE)法制备，然后用液相色谱-三重串联四极杆质谱进行定量分析，采集模式是电喷雾正离子多反应监测模式。本方法对猪肉样品中11种C2受体激动剂均获得了pg/g水平的检测限 (LOD)，动态校准范围为0.25-5ng/g，总体回收率为82%-105%，相对标准偏差 (RSD) 为1.6%-8.4%。 前言 β2受体激动剂是一种在肉类生产中违法使用的生长促进剂，能提高瘦肉率。它们是一种代谢调节剂，能将通常用于产生脂肪的能量转换成产生瘦肉的能量。最近，由于猪肉中高浓度2受体激动剂(瘦肉精)导致的中毒事件时有发生。本应用使用安捷伦Bond Elut PlexaPCX SPE柱从猪肉中提取和富集11种G2受体激动剂，然后用LC-MS/MS进行定量分析。表1是11种62受体激动剂的化合物名和结构。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 食品安全-兽药残留分析应用 表1.11种β2受体激动剂的化合物名和结构 应用文集 表1.11种G2受体激动剂的化合物名和结构(续) 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 食品安全-兽药残留分析应用 实验 试剂和化学品 所有试剂都是质谱、液相色谱或分析纯级别。 加入10mL饱和氯化钠溶液和10mL 异丙醇-乙酸乙酯 (60：40)并振荡5分钟。在4000 rpm下离心5分将，将有机层小心地转移至另一个离心管中。再次加入异丙醇-乙酸乙酯萃取，振荡，离心并收集上清液，重复两次，然后将所有的上清液合并。 乙腈和水购自Honeywell。标准品购自中国药品生物制品检定所(NICPBP)。猪肉购自当地超市。 在40℃下用氮气吹干。干留物用5mL0.2M醋酸钠(pH5.2)复溶。所得样品用于稍后的 SPE 纯化。 标准溶液(1.0mg/mL)用甲醇分别配制，并储存在-20℃。混合工作溶液(10pg/mL)用乙腈/水(10：90)配制并储存在4℃的条件下。加标溶液每周用混合工作溶液加适量水新鲜配制。 固相萃取 仪器和材料 ( 安捷伦1200高效液相色谱仪 ) 安捷伦6460三重串联四极杆液质联用仪 安捷伦Bond Elut Plexa PCX萃取柱， 60mg， 3mL(p/n12108603) 安捷伦Poroshell 120 EC-C18窄径柱，2.1×100 mm， 2.7 um (p/n695775-902) 固相萃取的步骤见图1。安捷伦 Bond Elut Plexa PCX 萃取柱用3mL甲醇和3mL水活化。将5mL样品溶液移到萃取柱上，通过重力作用(约1mL/min) 通过萃取柱。然后用2 mL水和2mL2%的甲酸溶液淋洗萃取柱。在最高真空度下维持3分钟，使萃取柱彻底干燥。用5mL 5%的氨水甲醇溶液洗脱(流速1 mL/min)。洗脱液用40℃氮气吹干。用1mL含0.1%甲酸的水/乙腈(90：10)溶液复溶。样品通过涡旋振荡和超声使残留物彻底溶解，然后用0.45 pm 膜过滤。样品转移至1.5 mL样品管， 并在3000转下离心5分钟。上清液转移至2mL色谱样品瓶，用于分析。 安捷伦Vac Elut 20 Manifold (p/n 12234101) 仪器条件 液相色谱条件 样品制备 液-液萃取 称取5克猪肉样品(±0.01g)，放入50mL带盖的聚丙烯管中。加入20mL 的0.2M醋酸钠 (pH 5.2)溶液，涡旋混匀。然后加入250 pL-葡萄糖醛酸酶(1000U/mL)，涡旋振荡2分钟彻底混匀样品，然后置于37℃下反应16小时。 酶解物振荡15分钟，然后在4000 rpm下离心10分钟，将4mL上清液转移至另一个离心管中。加入0.1M的高氯酸溶液调节pH至1±0.3。 在4000 rpm下离心10分钟，将上清液转移至另一只离心管中。用10M氢氧化钠溶液将pH调至11。 质谱条件 采用正离子模式对11个化合物进行监测。离子源参数见表2， MR-M参数见表3。 表2.用于11个化合物分析的质谱离子源参数 表3.11个化合物的MRM参数 碰撞电压(V) 图1.猪肉样品的提取和富集——固相萃取步骤 MRM 通道(m/z) 碰撞电压(V) 1)277.2>203.1 100 2) 277.2>259.1 沙丁胺醇 1)240.2>148.2 100 2)240.2>222.1 莱克多巴胺 1)302.2>164.2 110 2) 302.2>284.1 特布他林 1)226.1>152.2 100 2)226.1>170.2 沙美特罗 1)416.3>380.3 130 2)416.3>398.4 普萘洛尔 1)260.2>116.2 120 2)260.2>183.2 妥洛特罗 1)228.1>154.1 100 2)228.1>172.2 西马特罗 1)220.1>160.2 90 2)220.1>202.1 马布特罗 1)311.2>237.1 110 2)311.2>293.2 马喷特罗 1) 325.3>237.1 110 12 2)325.3>307.2 5 齐帕特罗 1)262.2>244.2 2)262.2>202.2 100 碰撞能量(V) 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 食品安全-兽药残留分析应用 结果与讨论 回收率和重现性 线性和检测限(LOD) 在三个浓度水平下测定了方法的回收率和重现性，分别为0.5、1.0和2.0ng/g(猪肉基质)。每个浓度水平重复六次。回收率和重现性数据见表5。1.0 ng/g加标猪肉样品的色谱图见图2。 用混合工作标液加入空白基质配制成系列标准溶液(0.25、0.5、1.0、2.0和5.0ng/g)，用于建立标准校正曲线。空白基质样品经过了全部的样品前处理过程，包括酶解，液-液萃取和固相萃取。校正曲线的结果见表4。以信噪比 (S/N) 大于3的最小浓度作为各化合物的检测限 (LOD)。11种C2受体激动剂的检测限(LOD)结果见表4。 表5.猪肉中B2受体激动剂的回收率和重现性 添加水平 RSD 化合物 (ng/g猪肉) 回收率(%) (n=6) w采集时间1分1 图2.1.0ng/g 加标猪肉样品提取物的色谱图 结论 本研究表明， 安捷伦Bond Elut Plexa PCX可以被用于复杂基质样品，如猪肉中G2受体激动剂的高效纯化和富集。基质加标样品的62受体激动剂的回收率和重现性都满足法规的要求。样品的基质效应和杂质含量都非常低，没有影响各目标化合物的定量分析。定量限(LOQ)远低于法规的最大残留限量 (MRL)。[1.2] ( 参考文献 ) ( 1. G B/T 21313-2007 "Analysis o f B2-Agonists i n F o ods ofAnimal Origin by High Performance L iquid Chromatography T andem Mass S p ectrometry." ) 2.SN/T1924-2007 "Determination of Clenbuterol， Ractopamine，Salbutamol and Terbutalin Residues in Foodstuffs of AnimalOrigin for Import and Export-HPLC-MS/MS Method. 更多信息 有关产品和服务的更多信息，请访问我们的网站www.agilent.com/chem/cn。 HCN捷伦样品制备选择指南及应用文集 HCNWWW.AGILENT.COM/CHEM/SAMPLEPREP：CN b2受体激动剂是一种在肉类生产中违法使用的生长促进剂，能提高瘦肉率。它们是一种代 谢调节剂，能将通常用于产生脂肪的能量转换成产生瘦肉的能量。最近，由于猪肉中高浓度b2受体激动剂(瘦肉精)导致的中毒事件时有发生。本应用使用安捷伦Bond Elut Plexa PCX SPE柱从猪肉中提取和富集11种b2受体激动剂，然后用LC-MS/MS进行定量分析。