肺癌细胞中血管生成--甲状腺转录因子-1（TTG-1）对影响肺癌细胞血管生成影响检测方案(实验器材)

血管生成--甲状腺转录因子-1（TTG-1）影响肺癌细胞血管生成 美国的科研人员通过对TTF-1的调控发现，TTF-1能直接调节血管内皮生长因子（VEGF），并且发现VEGF启动子上有多处TTF-1响应序列。 比如，VEGF的主要受体，VRGFR2显示出收到TTF-1的直接正调节。本文中显示，低氧并没有促进 TTF-1+肺癌细胞中的VEGF的表达。而采用外泌体培养基或者是去外泌体的培养基（EDM）时，TTF-1都能促进VEGF表达。但在研究中意外的发现TTF-1+肺癌细胞的去外泌体培养基（EDM-TTF-1+）能够内皮细胞的血管形成。 研究人员采用HUVECs，铺在基质胶上，加入EDM以及VEGFR1等蛋白质后孵育2-3小时，对比不同条件下的分枝数和节点数。 Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857 （一）实验材料和实验方法 1）细胞： HUVECs 104 cells/50μl 2）培养基： RPMI 3）基质胶： Basement membrane (Fisher Scientific, CB40234A) 10 µl per well 4) 试剂： A549 conditioned media (EDM) Recombinant human GM-CSF protein（250ng/ml，Peprotech，300-03） sVEGFR1 protein（20 ng/ml, RayBiotech,ELH-VEGFR1) Anti-GM-CSF antibody (R&D systems. MAB215) Anti-VEGFR1 antibody (R&D systems. AF321) 5）耗材： ibidi血管生成载玻片 (ibidi, 81506) 6）其他： 细格纸 实验步骤 准备基质胶 将10μl的Basement membrane以5mg/ml的浓度铺入ibidi血管生成载玻片的内孔中，注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。 盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。 准备一个10cm的培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒。 将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖。 37℃至少孵育30分钟，使基质胶完全固化。 怎么知道加了合适体积的Matrigel： 由于Matrigel流动性不强，并且有可能移液枪不准确，有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔，这样，必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。 如上图所示，垂直透过每个孔看下面的格子纸，如果格子被缩小了，那么就说明胶没加满，格子被放大了，那么胶就加多了，格子没发生什么变形，这才是刚刚加满下孔的状态。 铺细胞 在培养好的HUVECs细胞的60mm培养皿中加入5μg 的 Calcein-AM，染色45分钟。 胰酶消化细胞制成悬液，每孔种10000个细胞即可。准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液，充分混匀。 将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。 每孔加入50μl的细胞悬液，注意保持枪头垂直在上孔的上方，不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。 同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体，如果没有，加入无细胞的培养基，使上孔液体正好加满。 盖上盖，静置，一段时间后，所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。 不同培养基处理 采用EDM-EV，EDM-HDD，EDM-TTF-1处理细胞，并分别加入 rGM-CSF和rsVEGFR1，以Goat Ab和 Mouse Ab作为对照。37℃，培养2-3小时。 采集图像并统计结果 使用尼康TS100显微镜的40倍镜采集图像，并且用 ImageJ对其分枝数和节点数进行测量和统计。 实验结果 如图所示，使用EDM-TTF1处理的HUVECs血管生成被显著的抑制。当加入GM-CSF和VEGFR1后，血管生成也被显著的抑制，但当加入GM-CSF和VEGFR1的抗体后，血管生成的抑制也被取消，细胞又显出很强的血管生成结果。说明TTF-1上调了GM-CSF和VEGFR1的表达，抑制了血管生成的进程。