化妆品中糖皮质激素类药物检测方案(固相萃取仪)

全自动固相萃取-高效液相色谱串联质谱法检测化妆品中的糖皮质激素类药物 编号： DRET151217 摘要：参考《GB/T24800.2-2009化妆品中四十一中糖皮质激素的测定液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》标准，建立了利用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱串联质谱检测霜状化妆品中2种糖皮质激素药物的方法。样品经饱和食盐水分散，含0.1%甲酸的乙腈溶液提取，用 HLB柱(Hydrophile-lipophileBalance Cartridge， 亲水亲酯平衡柱)净化，转溶定容， 0.22 um 有机滤膜过滤后，用质谱检测器检测。结果表明回收率良好，重现性高。 关键词：化妆品，糖皮质激素类药物， EXTRA， HPLC-MS/MS 1引言 随着我国人民生活水平的提高，化妆品已成为必不可少的消费品之一，同时化妆品的安全性也成为关注度日益增长的话题。化妆品中添加的一些化学物质可能对人体健康具有潜在的危害。糖皮质激素类药物是一类临床常用药，具有调节糖、脂肪和蛋白质生物合成和代谢的作用，可抑制纤维细胞增生，减少5-羟色胺形成，有抗炎、抗过敏等作用，其对皮肤有一定的嫩白作用。但如长期使用含此类激素的化妆品，通过皮肤的吸收可能引起全身的副作用，导致皮肤变薄、血糖升高、向心性肥胖、高血压、骨质疏松、生长发育迟缓、免疫功能下降而诱发或加重感染等。我国《化妆品卫生规范》及欧盟化妆品规程中均明确规定糖皮质激素为化妆品中的禁用物质[1，2]。 本文参考 《GB/T 24800.2-2009 化妆品中四十一中糖皮质激素的测定液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》3，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合高效液相色谱-串交质谱联用(High Performance LiquidChromatography- Triple Quad Mass Spectrometry ， HPLC-MS/MS)检测糖皮质激素类药物在霜状化妆品中残留量的方法。2种糖皮质激素类药物的 CAS 号及分子结构式等信息见表1。在乙腈提取后，选用 EXTRA全自动固相萃取仪，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、淋洗、目标物洗脱和收集等步骤，收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换、定容后，用HPLC-MS/MS 检测。 表12种糖皮质激素类药物的中文名称、英文名称、CAS号、分子式及分子结构式 中文名称 英文名称 CAS 分子式 分子结构式 OH HO. H 二.O 氢化可的松 Hydrocortisone 50-23-7 C21H30O5 OH ^OH HO OH 甲基泼尼松龙 Methylprednisolone 83-43-2 C22H30O5 H H 2试剂、仪器及器材 2.1试剂 乙腈、甲醇、甲酸：色谱纯级； 定容试剂：取50mL 甲醇、50 mL 水混合均匀； 含0.1%甲酸的乙腈溶液：取100uL甲酸、100 mL 乙腈混合均匀； 100 ug/mL 糖皮质激素类药物标准储备液：分别准确称取标准品1 mg，，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100 ug/mL 的磺胺类标准储备液，-20℃以下保存； 基质标准工作曲线溶液：吸取适量糖皮质激素类标准工作液，用空白样品提取液配成 0.05 ug/mL、0.10ug/mL、0.20 ug/mL、0.40ug/mL、0.80 ug/mL 不同浓度的基质标准工作曲线溶液。 实验用水均为超纯水(电导率=18MQcm)， 取自 Milli-Q制水机(Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 固相萃取柱：HLB， 60mg/3 mL， 上海安谱公司； 全自动固相萃取仪：EXTRA，上海屹尧仪器科技发展有限公司； 高效液相色谱串联质谱联用仪： Agilent 1290 infinity - 6490 Triple Quad MS； 0.22 um 有机滤膜；分析天平；旋涡混合仪；超声波清洗仪；离心机；氮吹仪；移液枪； 50mL离心管；玻璃滴管；收集管；样品管； 实验中所用玻璃器皿使用前均均450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取(0.20±0.01)g样品，置于50ml离心管中，加入3 mL 饱和食盐水，<，于旋涡混合仪上混匀1min， 使膏体均匀分散。准确加入2mL含0.1%甲酸的乙腈溶液，振荡提取10 min，以4000 r/min 离心10min， 将上层清液收集于烧杯中，样品残渣再加入2mL含0.1%甲酸的乙腈溶液，重复萃取操作，合并提取液，加入20mL水，涡旋使混合均匀，取10 mL于进样管，待净化。 3.1.2净化 HLB 固相萃取柱依次用 5 mL 甲醇、10 mL水活化，取备用液过柱，流速1 mL/min， 待样品流尽后，用10mL 10%的乙腈水溶液淋洗固相萃取柱，待淋洗液流尽后，吹干小柱，用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液，具体程序见表2. 表2全自动固相萃取仪检测化妆品中的糖皮质激素类药物的净化程序 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL) (mL/min) (mL/min) 清洗 外壁 水 6 90 90 5 20 2 10 20 2 空气 0.5 6 6 上样 样品 10.5 20 空气 3 60 清洗 水 6 90 90 稀释 水 5 20 10 上样 样品 5.5 20 空气 12 60 清洗 水 6 90 90 淋洗 含10%乙腈的水 10 20 2 空气 50 60 20 洗脱 甲醇 4 20 空气 50 60 20 3.1.3定容 收集的洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，以定容试剂定容至1.0 ml， 经0.22 um 滤膜过滤后待进样。 3.2检测方法 3.2.1色谱条件 色谱柱为 Phenomenex Kinetex C18柱，长度100 mm，， 内径3.0mm， 涂层粒径2.6 um；柱温30℃，流速：0.25mL/min，进样量：10.0uL。流动相为超纯水(A)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序如下： 0-4 min 40% B， 4-5 min 25% B， 5-8 min 25% B， 8.01 min 40%B， 8.01-10 min 40% B。 3.2.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应选择监测(Multiple Reaction Monitoring， MRM)模式；鞘气温度 (Sheath Gas Temperature) 350℃，鞘气流速 (Sheath Gas Flow) 11 L/min， 氮气发生器提供；干燥气温度(Dry Gas Temperature)160℃，干燥气流速(Gas Flow)16 L/min，氮气发生器提供；雾化气压力(NebulizerPressure)30 psi； 喷嘴电压(Nozzle Voltage)1500V；碰撞气(Collision Gas)为高纯氮气，气体纯度≥99.999%。质谱 MRM 采集参数、目标物标准品的工作曲线线性范围及相关系数见表3， MRM谱图见图1. 表3目标物的 LC-MS/MS MRM 参数、线性范围、相关系数 Compound MS Parameters Linear PI DI CE Range R2 (m/z) (m/z) (eV) (ug/L) 氢化可的松 363.1 309.0*/121.0 15/20 0.1-100 0.9932 甲基泼尼松龙 375.4 161.3*/357.3 5/10 0.1-100 0.9969 图1目标物标准品的 MRM谱图 (浓度为1000 pg/mL) 4结果与讨论 4.1基底加标回收率及精密度 在(0.20±0.01)g空白样品中添加一定量的标准混合溶液，使样品中目标物的量达到1 pg/g 及 2pg/g，考察方法的回收率和重现性。采用基质标准工作曲线对样品进行计算，加标样品的 MRM 谱图见图2，基底加标回收率、相对标准偏差如错误!未找到引用源。所示： 表4基质加标工作曲线及相关系数、样品加标回收率及相对标准偏差 名称 基质加标工作曲线 (R2) 1 pg/g 2 ug/g Rec% RSD% Rec% RSD% 氢化可的松 Y=2454.3X+24704.5(0.9998) 74.7% 2.6% 87.1% 4.6% 甲基泼尼松龙 Y=6904.6X+3762243.4(0.9813) 87.4% 7.0% 99.8% 2.4% 图2加标样品的 MRM 谱图 4.2样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，空白基底干净，回收率符合要求，重复性好。采用基质标准工作曲线进行定量，可以减少基质对定量的影响，提高准确性。 5 结论 本方法采用乙腈对化妆品中的2种糖皮质激素类药物进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用高效液相色谱-串联质谱联用进行检测。检测结果表明，该方法抗干扰性强，回收率符合要求，重现性高。 ( 参考文献 ) ( [1]李娟，商少明，陈新，等.固相萃取-高效液相色谱法同时测定化妆品中6种糖皮质激素[].分析实验室， 2013，32(5)：77-80. ) ( [2]田媛，冯舒丹，黄美花，等.化妆品中糖皮质激素类非法添加物的 LC-MS/MS 分析[J].中国药科大学学 报，2 0 11，42(1)： 53-57. ) ( [3] 《GB/T24800.2-2009化 妆品 中四十一中糖皮质激素的测定液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》. )