化学药中主要物质含量分析检测方案

2 39001SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 钟新林赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：氯膦酸二钠、离子色谱 样品前处理 Key words： Ion chromatography； clodronate disodium 引言 氯膦酸二钠(Clodronate Disodium， CD)又名氯屈膦酸二钠，为第一代双膦酸盐类化合物，是近20年来发展起来的抗代谢性骨病的一类新药。多年临床研究表明，氯膦酸二钠疗效稳定，副作用较少，是控制骨溶解、修复溶骨病灶、减少病理性骨折产生的经典药物之一。《中国药典》2010年版拟收载该品种。 氯膦酸二钠分子结构中含有两个膦酸基团，极性强，易电离，不能在反相液相色谱柱上保留；而且结构中没有发色基团，不能用常规的紫外和荧光检测器测定。目前，该药物的分析方法有容量分析法1-4、柱前或柱后衍生离子色谱法15-81分析。国家现行质量标准中原料和制剂的含量测定采用容量分析法，需先破坏氯膦酸二钠结构产生氯离子，再用硝酸银滴定，不仅专属性差，而且操作复杂1-3。有国外文献和进口药品注册标准10用抑制电导型离子色谱方法测定氯膦酸二钠注射液有关物质的方法。例如，进口药品注册标准采用离子色谱方法测定氯膦酸二钠注射液的有关物质10，但含量测定则用与有关物质检查完全不同的色谱方法，需柱后衍生后用紫外光谱检测，装置复杂，设备繁多[10，11]。有关同时测定氯膦酸二含含量及其有关物质的分析方法尚未见报道。 离子色谱法是一种分析无机和有机阴、阳离子的重要技术，是普通液相和气相色谱分析离子型药物的重要补充，在药物分析领域的应用不断增多 12-14)。本研究用抑制电导型离子色谱法同时测定氯膦酸二钠及其制剂的含量和有关物质。 测试条件 仪器：ICS系列离子色谱带淋洗液发生罐系统。 流动相组成： KOH梯度淋洗0→20分钟，20→50mmol/L；20→24分钟， 50 mmol/L；24→25分钟，50→20mmol/L；25→30分钟，20mmol/L。 流速：1.2 mL/min 柱温：30℃ 检测方式：抑制型电导检测 进样量：25uL 有关物质的样品制备 精密称取氯膦酸二钠约15mg，置10ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得原料供试品溶液；精密量取注射液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得注射液供试品溶液。分别精密量取上述供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液。 含量测定的样品制备 精密称取氯膦酸二钠对照品约15mg， 置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密称取氯膦酸二钠约15mg，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得原料供试品溶液。精密量取本品2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取本品5ml， 置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得注射液供试品溶液。取装量差异项下的内容物，研细，精密称取细粉适量(约相当于氯膦酸二钠240mg)，置100ml量瓶中，加水适量，超声处理10分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得胶囊供试品溶液。 1有关物质 1.1色谱系统的确定 抑制型电导检测器对水溶液中离子状态存在的成分是―种具有较高灵敏度的通用型检测器。NaOH或KOH是一种非常理想的淋洗液，淋洗液中的Na*或K*在抑制反应中与再生液中H*发生交换，H*与OH结合成低电导的水，使淋洗液背景的电导大大降低，同时增加了被测离子的灵敏度。但这种碱性溶液非常容易吸收空气中的CO°， CO°在碱性溶液中转变成淋洗液强度较OH强的CO，导致高的噪音并改变色谱行为。淋洗液在线发生器可获得纯的OH溶液，与对OH^优化的亲水性分离柱结合后能获得基线变化极小的梯度淋洗系统，有望成为测定药品有关物质的种通用型分析手段。 抑制型电导检测离子色谱方法在测定药品杂质方面的应用已有报道[10，14)。进口药品注册标准JX20060101采用了复杂的曲线梯度洗脱方式，根据生产工艺只选择两种杂质进行测定。本文采用常见的线性梯度洗脱方式，主成分与各种杂质分离良好，见图1。 图1.不同有关物质测定方法结果比较(A：进口药品注册标准JX20060101方法；B：新拟定方法) Fig 1. Comparison between the results of relatedsubstances measured by the two methods (A： the methodof JX20060101； B： the new method) 氯膦酸二钠原料的国家现行质量标准还采用与标准氯化钠溶液和磷酸盐溶液比色的方法检查氯化物和磷酸盐，采用间接碘量法检查亚磷酸盐，操作过程冗长费时，需用多种化学试剂，消耗大量样品，灵敏度低而且有干扰。采用新的线性梯度洗脱方法，不仅能将杂质与主成分完全分离，而且氯离子、亚磷酸根离子和磷酸根离子均与其他杂质完全分离，因此可以替代现行质量标准的方法同时准确测定原料中的氯化物、亚磷酸和磷酸，大大提高检验效率。 1.2 检测限、溶液的稳定性和强制破坏实验 按信噪比为3计算，氯膦酸二钠的检测限约为0.3 ng。 表1.含量和有关物质测定结果 Table 1. Results of assay and related substances 取注射液供试品溶液1份，分别在0小时、17小时、19小时、20小时和23小时后进样，最大杂质含量和总杂质含量均无明显变化，主成分峰面积的RSD为0.6%。 取注射液液品5份，分别用0.1mol/L盐酸2ml、0.1mol/L氢氧化钠溶液2ml、3%过氧化氢溶液2ml、100℃加热1小时和3000Lx强光照射1天处理，考察降解产物与主成分的分离情况。结果显示，溶液状态下的氯膦酸二钠对热和氧化不稳定(图2)，加热和氧化后相对保留时间约0.37和0.17的杂质含量分别明显增加；对光、酸和碱稳定。固体状态下氯膦酸二钠性质稳定，在105℃加热18小时失去四个结晶水后杂质含量也几乎未增加。采用上述色谱条件，破坏性试验产生的各种杂质对主成分峰的测定无干扰。 图2.有关物质色谱图(A：供式品溶液；B：加热破坏；C：氧化破坏；1：氯膦酸二钠) Fig. 2 Chromatograms of related substances (A： testsolution； B： treated with heating； C：treated with 3% H202；1：CD) 样品 厂家 批号 有关物质% 含量% 最大单个杂质 总杂质 原方法 新方法(RSD%) 原料 A 自编1# 0.21 0.52 100.3 100.0 (0.3%) 自编2# 0.09 0.46 /* /* A 20061101 0.29 1.31 98.8 99.0 (0.02%) 注射液 A 20070501 0.19 0.90 100.7 101.8 (0.2%) B 060301 0.56 1.24 104.5 102.8 (0.3%) C 74090 0.08 0.26 102.8 100.6(0.1%) 胶囊 B MH2301 / / 99.0 96.0(0.4%) B MK2301 / / 100.8 98.3(0.3%) 1.3样品的有关物质 分别取对照溶液和取供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图，按主成分自身对照法计算最大杂质含量和杂质总含量，结果见表1。氯膦酸二钠在溶液中受热不稳定，而其注射液一般采用高温湿热灭菌的生产工艺，因此杂质含量比原料明显增多，需要进行控制。C厂批号为74090的注射液杂质含量最少。由于在上述色谱条件下，主成分色谱峰与各杂质色谱峰、各主要杂质色谱峰之间均基本完全分离，如有杂质对照品，可用更准确的对照品法或带校正因子的主成分自身对照法测定杂质。 2.1色谱条件的选择 在有关物质检查的色谱条件基础上，将梯度洗脱改为45mmol KOH溶液的等度洗脱测定含量，其他条件相同。按照注射液和胶囊处方称取适量的空白辅料配制成供试品溶液，结果显示辅料不干扰主成分的含量测定。用水溶液中常见的氟、碳酸根、硫酸根、溴、硝酸根和原料中需要控制的氯、亚磷酸根和磷酸根八种离子与氯膦酸二钠对照品溶液混合后进样分析，在上述色谱条件下氯膦酸二钠与八种阴离子能完全分离(图3)，主成分色谱峰出峰时间约为7.2分钟。 图3.含量测定色谱图 (A： CD与8种阴离子混合溶液；B：注射液供试液；C：胶囊供试液；1：氯膦酸二钠) 采用抑制型电导检测器的离子色谱系统比传统的液相色谱系统需要更长的平衡时间。在本文的色谱条件下，般需要至少预先平衡约1天时间，如抑制器为新抑制器或长时间未使用，则需要更长的平衡时间。适当增大抑制器电流可加快系统的平衡。例如，连续平衡1天后注射液含量测定的6次进样重复性和6小时溶液稳定性分别为0.6%和0.8%，连续平衡2天后胶囊含量测定的6次进样重复性和6小时溶液稳定性分别为0.2%和0.3%，均优于文献报道的柱后衍生离子色谱法1。采用供试品溶液与对照品溶液平行进样的方式也能减少抑制型电导离子色谱方法的误差。 2.2回收率 按注射液和胶囊处方，分别精密称取氯膦酸二钠和辅料适量，配成相当于测试浓度80%、100%和120%的三种浓度的溶液，每个浓度各三份供试品溶液，按上述方法测定含量，注射液和胶囊的平均回收率为分别为100.1%和98.9%，RSD分别为0.7%和0.6%(n=9)。 2.3线性范围、重复性和溶液的稳定性 精密称取四水氯膦酸二钠对照品23.85mg， 置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别精密量取3ml、5ml、7ml、8ml分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别进样测定。以峰面积A对浓度c进行线性回归，得回归方程为A= 50.151c-0.255 (r=0.9999， n=5)。表明氯膦酸二钠浓度在0.0568~0.1895mg/ml范围内，峰面积与测定浓度呈良好的线性关系。 取注射液和胶囊供试品溶液各一份连续进样6次，主成分峰面积的RSD%分别为0.6%和0.2%。 取注射液和胶囊供试品溶液各1份，分别连续6小时进样，主成分峰面积的RSD分别为0.8%和0.3%。 2.4样品含量测定 分别取对照品溶液和供试品溶液进样测定，按外标法以峰面积计算含量，测定结果与原方法的比较见表1。其中，原料为按国家现行标准的容量分析法检验，按干燥品计算的含量结果；制剂为厂家按照国家现行标准的自检结果。可以看出，离子色谱方法与原方法的测定结果基本一致。该方法无需对样品进行特殊处理，操作更简单，检验更快捷，专属性更强。 结论 离子色谱法在检测离子型或可离子化药物方面具有很大的优势。氯膦酸二钠在水溶液中呈弱酸性，在碱性介质中可转变成为阴离子，因此可以用离子色谱法测定其含量及有关物质。本研究应用抑制电导型离子色谱法同时测定氯膦酸二钠及其制剂的有关物质和含量，方法准确、灵敏、专属、快速，避免了复杂的样品预处理和衍生化过程，同时测定多种组分，能更好地控制氯膦酸二钠及其制剂的产品质量。 ( [1 ] State Food and Drug Administration (国家食品药品监 督管理局). 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