小鼠DC 细胞系中蛋白质检测方案(液质联用仪)

顾培明 李 静赛默飞世尔科技(中国)有限公司 目前，蛋白质组学研究已经由传统的大规模鉴定逐步转向了靶向蛋白质组学，研究内容已经由蛋白质鉴定扩展到了蛋白质相对和绝对定量，蛋白质相对定量方法中应用最普遍的为标记定量，包括： ICAT， DIART， ICPL，TMT， iTRAQ 等等，其中又以 TMT 以及 iTRAQ 的应用最为广泛。 传统的TMT以及 iTRAQ 标记实验均使用MS2碎片报告离子来进行定量，但是Steven P Gygi 等人发现该方法由于母离子筛选过程易受到基质干扰，因而定量结果与真实值相比偏低，而使用MS3碎片报告离子来进行定量，则可以很好的解决这一问题，该方法的基本原理为：母离子碎裂产生的 MS2 子离子用于定性，同时挑选碎片离子中强度最高的一个或者多个碎片离子，使用 HCD 进行进一步的碎裂，产生的报告离子用于定量，虽然质谱在选择母离子时易受到基质的干扰，但是选择出来的母离子中绝大部分为目标母母子，因而 MS2子离子中强度较高的碎片离子绝大部分来自于目标母离子，挑选这些子离子的报告离子去做定量，定量结果会显著优于传统的应用MS2 碎片报告离子的定量方法。 本文主要介绍了赛默飞世尔新一代三合一高分辨质谱仪Orbitrap Fusion 应用 SPS MS3 定量方法以及MS2 定量方法对TMT标记样本进行定性与定量的实验，并对两种方法得到的结果进行了比较。结果显示： MS2定量方法比 SPS MS3定量方法可以鉴定并定量到更多的蛋白质， 而 SPS MS3定量方法与 MS2 定量方法相比可以鉴定并定量到更多低丰度的蛋白质，同时其定量结果也更加可靠。 2.1样品信息 小鼠DC细胞系，分别进行两种不同的处理，连同对照组，抽提蛋白质，酶解，分别使用TMT标记为127，130， 131， 其中对照组标记为127，标记完成后，三种标记的样本混匀，使用 pH10， RP梯度进行分级，共得16个馏分。 2.2实验流程 样本使用A液(0.1%FA， H，0)复溶，均上样4.5ul， 60 min 色谱梯度分离，使用 Orbitrap Fusion 对样本进行定性以及定量分析，质谱方法分别使用传统的 MS2定量方法以及SPSMS3 定量方法。 2.3仪器条件 2.3.1高效液相色谱条件 高效液相色谱仪： Thermo Scientific Easy-nLC 1000色谱柱：Easy-spray column(C18 ，3 pm， 100A ，75 pm×15cm)； 上样量：均4.5pL 流动相： A：0.1% Formic acid in water；B：0.1% Formic acid inAcetonitrile 色谱梯度： Time mm：ss Duration [mm：ss1 Flow [nl/min] Mixture [号B] 00：00 00：00 350 2 03：00 03：00 350 45：00 42：00 350 55：00 10：09 350 56：00 01：00 350 60：00 04：00 350 2.3.2质谱条件 MS1： Orbitrap 2.3.2.1 MS2定量方法 分辨率：120000@m/z200 质谱仪： Orbitrap Fusion 扫描范围： m/z 400-1800 喷雾电压：2.1kV MS2： lon Trap 毛细管温度：275℃ |solation Mode：Quadrupole S-lens： 60% Activation Type：：CID 碰撞能量：40%HCD Collision Energy： 30% 分辨率设置：：一级120000@m/z 200，，二级15000@m/z 200 MS3： Orbitrap 母离子扫描范围： m/z350-1800；子离子扫描范围： startfrom m/z 100 Precursor Exclusion： low： 30， high：5 Number of Notches：10 Isolation Mode： Quadrupole Isolation Mode： lon Trap Data Dependent Mode： Top Speed Activation Type： HCD Cycle Time： 3s Collision Energy： 65% Exclusion Time： 70s 分辨率：30000@m/z 200 2.3.2.2 SPS MS3定量方法 扫描范围： m/z100-400 质谱仪：.：Orbitrap Fusion 喷雾电压： 2.1 kV 3.1 MS2 定量方法 毛细管温度：275℃ S-lens： 60% Data Dependent Mode： Top SpeedCycle Time： 3s 原始文件(raw file)使用 Proteome Discoverer 1.4软件搜索Uniprot_mouse.fasta数据居(数据库编号10090)，检索结果通过严格标准进行筛选(1%FDR)。 3.1.1鉴定结果汇总 Exclusion Time： 70s 样本编号 Protein Group Quantified Protein Group Unique Peptide Peptide 1 124 121 173 228 2 43 40 47 58 3 96 93 112 131 4 31 26 34 38 5 103 101 113 134 6 263 255 288 349 7 613 609 803 1018 8 228 225 262 316 9 647 637 934 1224 10 934 927 1360 1877 11 1110 1106 1972 2930 12 1156 1150 2059 3182 13 893 892 1693 2464 14 746 739 1289 2127 15 1113 1111 2507 4567 16 1247 1241 3334 5845 TOTAL 3022 2994 15606 27603 Sample Number Distribution of Protein Group Identified and QuantifiedUsing MS2 Quantitation Method among 16 Samples Sample Number Distribution of Peptide and Unique Peptide ldentifiedUsing MS2 Quantitation Method among 16 Samples 3.2 MS3 定量方法 由上述表格以及柱状图可以看出，在16h小时的时间内，一共鉴定到了3022个蛋白质，其中有2994个蛋白质有定量信息(即131/127，130/127均有定量结果)，显示了Orbitrap Fusion 优异的定性与定量能力。 原始文件(raw file)使用 Proteome Discoverer 1.4软件搜索Uniprot_mouse.fasta 数据库(数据库编号10090)，检索结果通过严格标准进行筛选(1%FDR) 。 3.2.1鉴定结果汇总 Protein Group Quantified Protein Group Unique Peptide Peptide 1 263 203 344 433 2 103 64 111 136 3 319 251 390 478 4 241 154 282 326 5 359 276 426 513 6 391 349 460 553 7 618 572 821 996 8 428 371 524 646 9 582 510 844 1023 10 651 621 914 1198 11 806 782 1301 1752 12 835 798 1384 1885 13 782 762 1425 2019 14 810 775 1518 1982 15 788 763 1551 2037 16 916 886 2172 2842 TOATL 2788 2612 12812 19444 Sample Number Distribution of Protein Group Identified and QuantifiedUsing SPS MS3 Quantitation Method among 16 Samples Sample Number Distribution of Peptide and Unique Peptide IdentifiedUsing SPS MS3 Quantitation Method among 16 Samples 由上述表格以及柱状图可以看出，在16h小时的时间内，一共鉴定到了2788个蛋白质，其中有2612个蛋白质有定量信息(即131/127，130/127均有定量结果)，显示了 Orbitrap Fusion 优异的定性与定量能力。 4..NMS2 定量方法与 SPS MS3 定量方法结果比较 4.1定性与定量蛋白质数目比较 Sample Number Protein Group Identified by Two Methods Sample NumberProtein Group Quantified by Two Methods 由上图可以看出 MS2定量方法与 SPS MS3 定量方法相比较，前者在定性与定量蛋白质数目要高于后者，由于 SPSMS3定量方法需要将母离子在IT中碎裂后，再挑选碎片离子去做 SPS MS3， 因而采集速度会慢于 MS2 定量方法，导致定性与定量蛋白质数目都略少。 此外，在样本1-6以及样本8中可以看出 SPS MS3 定量方法可以鉴定并定量到更多的蛋白质，虽然 SPS MS3 定 由上图可以看出，MS2定量比值的 log2 值绝大部分在-1与1之间， 而 SPS MS3 定量比值的 log2 值有部分小于-1或者大于1，与文献报道相一致，MS2由于受到基质干扰的影响，蛋白质定量比值与真实值相比会有所差异，定量差异偏小。 本次实验比较了最新高分辨质谱仪 Orbitrap Fusion 使用MS2 定量方法以及 SPS MS3 定量方法在定性与定量蛋白质数目以及定量结果之间的差异，在16h的总检测时间内， MS2定量方法一共鉴定了3022个蛋白质，其中有2994个蛋白质有定量结果， SPS MS3定量方法一共鉴定到了2788个蛋白质，其中有2612个蛋白质有定量结果。从结果看，由于MS2 定量方法的扫描速度要略高于 SPS MS3 定量模式的扫描速度，因而最终的结果显示前者可以鉴定并定量到更多的蛋白质，但是 SPS MS3 定量方法可以鉴定并定量到更多低丰度的蛋白质，此外，由于 MS2定量方法容易受到基质干扰，定量差异偏小，结果不够准确。 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118400 6505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_CM 本次实验比较了最新高分辨质谱仪Orbitrap Fusion 使用MS2 定量方法以及SPS MS3 定量方法在定性与定量蛋白质数目以及定量结果之间的差异，在16h 的总检测时间内，MS2 定量方法一共鉴定了3022 个蛋白质，其中有2994 个蛋白质有定量结果，SPS MS3 定量方法一共鉴定到了2788个蛋白质，其中有2612 个蛋白质有定量结果。从结果看，由于MS2 定量方法的扫描速度要略高于SPS MS3 定量模式的扫描速度，因而最终的结果显示前者可以鉴定并定量到更多的蛋白质，但是SPS MS3 定量方法可以鉴定并定量到更多低丰度的蛋白质，此外，由于MS2 定量方法容易受到基质干扰，定量差异偏小，结果不够准确。