大鼠血浆中人重组干扰素检测方案(液质联用仪)

4 应用 Target MS2 方法对大鼠血浆中人重组干扰素进行绝对定量的测试方案 顾培明 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 随着蛋白质组学的不断发展，蛋白质组学已广泛深入到生物学研究的各个领域，目前，蛋白质组学研究已经由传统的大规模鉴定逐步转向了靶向蛋白质组学，研究内容已经由蛋白质鉴定扩展到了蛋白质相对和绝对定量，对复杂样本中蛋白质的相对与绝对定量有助于发现疾病的生物标志物，对于研究各类疾病的发生与发展有着重要的意义。 基于质谱的蛋白质组学定量方法主要有 SILAC， TMT，iTRAQ以及应用三重四级杆的MRM 等，本文主要介绍了赛默飞世尔新一代台式高分辨质谱仪 Q-Exactive 在目标蛋白质定量方面的应用。结果显示Q-Exactive 不仅可以在 ng级上样量情况下达到98%以上的蛋白质氨基酸序列匹配度，同时应用 target ms2 方法，，可以很好的对复杂样本中目标蛋白质进行绝对定量，其定量下限达到了 amol，动态范围达到了6个数量级，且线性相关系数在0.99以上。 2.实验部分 2.1样品信息 人重组干扰素α-2b标准品(浓度为1mg/ml)，注射人重组干扰素α-2b后的处理组大鼠血浆样本以及空白大鼠血浆样本。 2.2实验流程 1.使用 Full MS/ddMS2 方法对人重组干扰素 α-2b标准品酶解的肽段进行鉴定，筛选其 unique peptide； 2. 将人重组干扰素 αx-2b标准品酶解肽段稀释成不同浓度的标准品，其浓度分别为 10*ng/ml， 10'ng/ml， 10ng/ml，10'ng/ml， 10'ng/ml， 10ng/ml，并掺入至空白大鼠血浆样本酶解肽段中，分别上样18ul，使用 Target MS2 方法根据其 unique peptide 的 fragment ion 峰面积，绘制标准曲线； 3.处理组大鼠血浆酶解肽段上样18ul，根据其 uniquepeptide 的 fragment ion 峰面积计算出大鼠血浆中人重组干扰素 α-2b的浓度。 2.3仪器条件 2.3.1高效液相色谱条件 高效液相色谱仪： Thermo Scientific Easy-nLC 1000 色谱柱： C18，3pm，100A ，75pm×15 cm 上样量：均18 ul 流动相： A：0.1% Formic acid in water；B：0.1% Formic acidin Acetonitrile 色谱梯度： Time mm：ss Duration [mm：ss] Flow [nl/min] Mixture [%B] 00：00 00：00 350 3 05：00 05：00 350 8 42：00 37：00 350 20 47：00 05：00 350 30 50：00 03：00 350 90 60：00 10：00 350 90 S-lens： 50% 碰撞能量：27%HCD 分辨率设置：35，000@m/z 200 Isolation Window： 4M/Z Inclusion List： M/Z 451.75 3结果分析 3.1筛选定量肽段 首先使用 Q-Exactive 对人重组干扰素 α-2b标准品的酶解肽段进行 Full MS/ddMS2 扫描，上样量为500ng(不计酶解损失)，筛选人重组干扰素 α-2b的 unique peptide， 该肽段必须为人重组干扰素 α-2b所特有的肽段，才可以用于表征人重组干扰素α-2b的量。 下图展示的为人重组干扰素α-2b色谱质谱的原始图，图中可见，整个色谱峰分离比较均一，强度比较高。 RT： 0.00-60.00 SM： 7B 将上述得到的原始文件使用 Byonic 软件进行搜库处理，观察蛋白质的序列匹配度，数据库使用 DrugBank 下载的人 重组干扰素 α-2b的氨基酸序列。 ProteinName LogProb BestLogProb Bestscore lotalIntensity # ofspectra # ofuniquepeptides # of modpeptides Coverage% # AA'sinprotein IFN -314.48 -13.80 906.90 7312135064.4 929 137 39 98.18 165 从上述表格可见，人重组干扰素 α-2b的氨基酸序列匹配度达到了98.18%，说明Q-Exactive 的超高灵敏度，在不到500ng 的上样量的情况下可以对蛋白质进行高氨基酸序列匹配度的分析，对于后续数据分析的可靠性非常重要。 下图展示的是人重组干扰素α-2b的具体氨基酸序列匹配情况。图中绿色标记的氨基酸序列为鉴定到的氨基酸，红色标记的为鉴定到的带有修饰的氨基酸，黑色标记的为实验中没有鉴定到的氨基酸。 D：\WorkL..lelute_standard_IFN_E5 2013/1/1716：20：13 下图为上述的肽段 EDSILAVR 二级谱图的解析情况，图中可见所有的y系列离子均被鉴定到，子离子的实测 m/z 与理论 m/z偏差均在10°水平，谱图质量非常高，结果非常可信。另外，从二级谱图中可以看出，二级碎片子离子 y4， m/z 458.31，其强度最高，因而在随后的数据分析中选取451.75-458.31这一母离子-子离子对来表征 EDSILAVR的含量，进而表征人重组干扰素 α-2b的含量(该方法即为选择反应监测技术： SRM Selected Reaction Monitoring)。 3.2标准曲线绘制 人重组干扰素 α-2b酶解的标准肽段稀释成以下几个浓度： 10ng/ml， 10*ng/ml， 10ng/ml， 10'ng/ml， 10'ng/ml，10ng/ml， 各自吸样8ul， 与10ul空白血浆酶解的肽段 样本混匀，上样18ul，质谱检测，检测方法使用 TargetMS2， inclusion list 为 m/z 451.75， isolation window 为 4 m/z。对子离子458.31进行抽提，结果见下图。 Time (min) EDSILAVR的洗脱峰，分别对各个色谱峰的峰面积(即上图中色谱峰上显示的 MA 数值)进行积分，结果见下述表格。 浓度(ng/ml) 浓度 (pg/ul) 上样体积(ul) 干扰素总量(pg) 峰面积 1.00E-02 1.00E-02 8 8.00E-02 307 1.00E+00 1.00E+00 8 8.00E+00 39622 1.00E+01 1.00E+01 8 8.00E+01 823109 1.00E+02 1.00E+02 8 8.00E+02 10926605 1.00E+03 1.00E+03 8 8.00E+03 88248233 1.00E+04 1.00E+04 8 8.00E+04 984241101 干扰素总量(pg)―-峰面积 从上述结果中可以看出，在6个数量级的浓度范围内， 的检测动态范围足够大，可以很好的应用于蛋白质药物浓度与峰面积的线性相关系数在0.99以上，说明 Q-Exactive 代谢动力学研究。 大鼠血浆样本上样18ul，质谱检测，原始结果见下图，图中可见在 35.33min 有一个明显的色谱洗脱峰出现，洗脱 时间与上述的标准品的洗脱时间相一致，为血浆样本中的人重组干扰素 α-2b的肽段 EDSILAVR的洗脱峰，对m/z458.31这一子离子的面积进行积分。 Time (min) 峰面积为9787，代入上述的标准曲线中进行计算，得出原始血浆中人重组人扰素 α-2b 浓度为 26.9185 ng/ml。4总结 综上所述， Q-Exactive 拥有超高的灵敏度，在不到500ng上样量的情况下对人重组干扰素 α-2b的氨基酸序列匹配度 达到了 98.2%；Q-Exactive 拥有足够高的动态范围，在对人重组干扰素 α-2b的标准品检测中，其动态范围达到了6个数量级，并且线性相关系数达到了0.99以上。简而言之，Q-Exactive 的超高性能可以很好的应用于大分子药物代谢的研究中去。 ThermoFisherSCIENTIFIC AN_CM