从小鼠胚胎中分离胚胎干细胞的方法

从小鼠胚胎中分离胚胎干细胞的方法   设备和试剂 --6厘米细菌培养皿 --M2培养基+1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma） --M16培养基+ 1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma） --BLS胚胎聚集针（DN-10 或DN-09） --ES细胞单细胞悬液 --窄口移液管（处理细胞和胚胎）来自Pasteur移液管或其他合适的玻璃毛细管（移液管内径的应〜 100μm ） --来自雌性促排卵的八细胞胚胎 -- Tyrode’s液，酸性（ sigma） --CO2孵化器   A：准备聚集穴 1.在细菌培养皿滴6 滴M16培养培养基+牛血清白蛋白，然后覆上石蜡油 2. 胚胎聚集针（BLS DN-10或DN-09）通过石蜡油和培养基按压塑料表面，在每滴下面制作出 12-16个低压穴，胚胎聚集针（BLS DN-10或DN-09）需用酒精清洗 3.将培养基放置于孵化器内，用CO2预均衡培养基 B.ES细胞的制备 1.将ES单细胞悬液放置在细菌培养皿中的ES细胞培养基中孵育1-2小时。在此期间，它们将会聚集成由5-10个细胞组成的细胞部落。 2．使用窄口移液管将ES细胞落（5-10个细胞）放入聚集穴内。 C.胚胎制备和聚集 1.从2.5天促排卵或自然交配的小鼠输卵管提取八倍体胚胎并在M2培养基中冲洗。 2.用3滴M2培养基清洗胚胎 3.通过简短的接触酸性灌流液除去胚胎透明带。用移液管在一滴酸Tyrode’s液上释放10-20胚胎，保持胚胎悬浮在溶液中，直到透明带溶解。注意不要让胚胎落到液体的底部并接触塑料，以免刺穿。 4.将胚胎转移回M2培养基 5.通过四滴M16 + BSA培养基清洗胚胎。 6.在预先准备好的聚集穴中，将一个胚胎与每个胚胎细胞落接触 7.将培养皿转至孵化箱内，孵化一晚。 8.将压缩的或早期空泡桑椹胚移植到受体子宫角