电融合仪BLS在猪卵母细胞孤雌激活中的应用

电融合仪BLS在猪卵母细胞孤雌激活中的应用 电融合仪BLS在猪卵母细胞孤雌激活中的应用* 刘晓1，2 张庆桥3 潘登科2** 陈扣扣2，4 张卫红2，4冯冲2，4 冯书堂2 （1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所, 兰州,730050；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094；3.河北工程大学，邯郸，056038；4.甘肃农业大学,兰州,730070) 摘要:目的 建立并优化BLS细胞融合仪 (​http:​/​​/​www.fhsci.com.cn​/​fhsci_Category_419294_1.html" \t "http:​/​​/​www.fhsci.com.cn​/​_blank​)在猪孤雌胚体外生产中的使用条件，同时为克隆胚的生产提供数据参考。方法 以体外成熟的猪卵母细胞为研究对象，研究了不同的电场强度、脉冲时程和脉冲次数对猪卵母细胞电激活效果及其对孤雌胚发育率的影响。结论 电激参数(1.2KV/cm 、100μs、2次脉冲)能够得到较高的卵裂率和囊胚率(70%、30%左右)；BLS细胞融合仪是一种经济高效的胚胎激活仪。 关键词: 猪；孤雌激活；BLS融合仪 中图分类号：S828.3 文献标识码：A 文章编号： 猪的解剖及生理结构与人类很相似，是研究人类疾病的理想实验动物，在生物医学领域中得到广泛应用[1-3]。小型猪以其作为异种器官移植供体的独特优越性，日益成为国内外研究的新热点[4]。人源化基因猪的研究和应用对猪的胚胎生物技术中起到了积极的推动作用，而卵母细胞的激活又是这些研究的重要环节之一。 哺乳动物卵母细胞的人工激活有物理和化学的方法[5]。有报道，化学激活刺激猪卵母细胞激活率低，电激活的卵裂率明显高于化学激活。迄今为止出生的核移植猪主要采用电激活方法获得的。目前常用的电融合仪主要是产于美国、日本和澳大利亚，价格昂贵。匈牙利生产的一种简易便携电融合仪BLS，专为哺乳动物胚胎电融合而设计，此仪器主要应用于生产小鼠四倍体胚胎，在猪的卵母细胞激活和克隆胚的融合激活中很少应用。本实验旨在探索BLS细胞融合仪的不同电激活参数条件对猪体外成熟卵母细胞人工激活效果的影响，优化BLS细胞融合仪在猪孤雌胚体外生产中的最佳条件，并为猪体细胞重构胚胎的融合激活及四倍体制备提供一种高效设备。 1 材料和方法 1.1试验材料 所有化学试剂均购自Sigma公司；卵母细胞体外成熟（IVM）以及胚胎培养耗材分别为NUNC，Greiner (German)公司产品。 1.2 主要溶液 抽卵液PVA-DPBS为无钙的PBS缓冲并添加了0.1%(质量体积比) 聚乙烯醇(PVA)配成；卵母细胞体外成熟（IVM）液为无BSA 的NCSU-23(North Carolina State University23)添加10%(体积比)猪卵泡液(PFF)，10 ng/mL表皮生长因子(EGF)，10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG) 和10IU/mL 孕马血清促性腺激素(PMSG)；融合/激活液由0.28 mol/L 甘露醇，0.1 mmol/L 氯化钙，0.1 mmol/L 氯化镁，0.5 mmol/L HEPES 以及0.01%PVA组成；胚胎培养基为PZM + 0.3% BSA；0.1%透明质酸酶。 1.3 试验方法 1.3.1 猪卵母细胞体外成熟（IVM） 从屠宰场取母猪卵巢，放入30-35℃含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，5 h 内运回实验室。用配有18G针头的20 mL注射器抽吸卵巢上直径3-6 mm的卵泡，经 PVA-DPBS洗涤3遍后挑选卵丘包裹3层以上，致密且胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)， 再用IVM培养液洗涤3遍。将洗涤好的COCs转入IVM培养液中培养。COCs在39℃，5％CO2，100％湿度的CO2培养箱中成熟 20- 22h后，转移到未添加激素的IVM液中继续培养20-22h，用0.1% 透明质酸酶脱去包裹在其周围的卵丘细胞，卵周隙明显、卵细胞膜完整且排出第一极体的卵母细胞视为成熟卵母细胞。 1.3.2 卵母细胞孤雌激活 取上述脱去卵丘的MⅡ卵母细胞，用激活液洗涤3遍。再将卵母细胞转移到已经铺满激活液，电极宽度为0.5mm的融合槽中，用CF-150B（BLS）细胞融合仪以不同电场强度（1.6KV/cm、1.2KV/cm、0.8KV/cm、0.6KV/cm）、不同脉冲次数（1次、2次、3次）、不同脉冲时程（50μs、100μs、150μs）进行诱导激活。洗涤后将卵母细胞转移到PZM3 + 7.5μg/mL CB（细胞松弛素B）的液滴内作用4h, 然后转移到PZM3中, 48h和168h观察胚胎的卵裂和囊胚发育情况。 注：实验中除被检验的参数外，其他条件均保持不变。 1.4 数据处理 每个处理重复4次，数据结果用SAS 的ANOVA 过程进行分析，Duncan’s 检验方法判定处理间的差异显著性，当P < 0.05时认为差异显著。 2 结 果 2.1 电场强度对猪卵母细胞孤雌激活的影响 脉冲时程100μs、脉冲次数2次，以不同电场强度（0.6KV/cm、0.8KV/cm、1.2KV/cm、1.6KV/cm）诱导卵母细胞激活。随着场强的增加，卵裂率和囊胚率升高，但在1.6KV/cm时，胚胎死亡率急剧上升，结果见表1。电场强度为1.2KV/cm时，卵裂率和囊胚率分别达到(72.5%、34.5%)，显著高于其它组（P<0.05）。 表1 不同电场强度对猪卵母细胞孤雌激活的影响 电场强度（KV/cm） 作用卵数 2-4cell胚胎数(%) 囊胚数(%) 1.6 180 48(26.7a） 22(12a) 1.2 155 111(72.5b) 54(34.5b) 0.8 135 77(57.8c) 16(12.5a) 0.6 155 66(39.5d) 14(9a) 同一栏内上标不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。 2.2 脉冲次数对猪卵母细胞孤雌激活的影响 脉冲时程100μs、电场强度为1.2KV/cm时，脉冲次数并未对卵裂率、囊胚率造成显著影响（P>0.05），结果见表2。电场强度1.2KV/cm、100μs、2次脉冲处理时卵裂率和囊胚率要高于1次及3次脉冲处理, 分别达到了(68.5%、26.7%)。 表2 不同脉冲次数对猪卵母细胞孤雌激活的影响 脉冲次数 作用卵数 2-4cell胚胎数(%) 囊胚数(%) 1 150 95(63.0a) 30(20a) 2 180 123(68.5a) 48(26.7a) 3 180 80(44.5a) 27(15a) 2.3 脉冲时程对猪卵母细胞孤雌激活的影响 电场强度为1.2KV/cm、脉冲次数2次，不同脉冲时程诱导卵母细胞激活，结果见表3。脉宽100μs时, 孤雌胚的卵裂率及囊胚率显著高于其它组（P<0.05）, 达到了(77.5%、33%)，但脉冲时程的进一步增加并不能使卵母细胞激活后的发育率升高。 表3 不同脉冲时程对猪卵母细胞孤雌激活的影响 脉冲时程 作用卵数 2-4cell胚胎数(%) 囊胚数(%) 50μs 200 125(67a) 45(22.5a) 100μs 200 155(77.5b) 66(33b) 150μs 200 134(62.5a) 54(27b) 3 讨 论 电刺激是一种应用最为广泛的卵母细胞激活方法，高压直流电脉冲短时间作用于卵母细胞，可以使卵细胞膜上生成暂时性孔洞，细胞内外的离子和大分子借此进行交换，引起细胞内游离钙升高，从而激活卵母细胞。电脉冲引起的微孔大小受脉冲强度、时间和脉冲次数的影响。多数报道是以激活率和囊胚发育率为标准，本试验获得了BLS细胞融合仪激活猪卵母细胞的适宜条件：1.2KV/cm、脉宽100μs的2次直流刺激，并取得了较高的卵裂率（70%左右）和囊胚发育率（30%左右），略高于潘登科等[6]用ECM2001(美国)电融合仪激活卵母细胞的孤雌胚囊胚发育率20-30%，也高于刘国世等[7] 使用日本电激仪(Embryo cell fusion system，Fujira Industry Co．Ltd，Japan)激活卵母细胞的的孤雌胚囊胚发育率18.9%，高于曹胜兰等[8]使用国产宁波新芝电激仪激活卵母细胞的囊胚率（21.54%）。 本研究建立并优化了BLS细胞融合仪在猪卵母细胞孤雌激活的条件，为体细胞核移植重构胚的融合激活提供了数据参考。最近丹麦科学家等[9]使用该仪器已经获得了徒手体细胞克隆猪，这些都说明了BLS细胞融合仪作为一种便携、微型、价廉的电激仪，在猪的胚胎工程中具有较好 的性能，将在我国的猪胚胎生物技术领域发挥重要作用。 参考文献 [1] Hsu Q K. Pig model for biomedical research. Taiwan: Pig Research Institute, 1982, 3～10. [2] Bustad L K, McClellan, R O. Swine in Bomedical Research. Pacific Nothernest Laborotary Richland W A.1996 [3] Panepinto L M. Swine in biomedical research. Lab Anim Sci, 1986, 36(4):339～433. [4] 芮荣, 鲍世明.小型猪实验化及其在胚胎工程领域的应用前景. 四川农业大学学报,1999,17(2):230～231. [5] 李月涛,冯广鹏,魏红江,等.猪卵母细胞孤雌激活的研究.安徽农业科学,2007,35(8):2289～2290. [6] 潘登科，刘吉，牟玉莲，等.氧分压、培养基及生长因子对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响.农业生物技术学报，2007,15(4):715～716. [7] 刘国世,曾申明,吴中红,等.不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响.畜牧兽医学报,2004,35(6):615～620. [8] 曹胜兰，李跃民，刘贞伟. 电激活对猪卵母细胞孤雌发育的影响.育种繁殖, 2006,194: 33～35. [9] Du Y (​http:​/​​/​www.ncbi.nlm.nih.gov​/​sites​/​?Db=pubmed&Cmd=Search&Term="Du Y"[Author]&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus​), Kragh PM (​http:​/​​/​www.ncbi.nlm.nih.gov​/​sites​/​?Db=pubmed&Cmd=Search&Term="Kragh PM"[Author]&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus​), Zhang Y (​http:​/​​/​www.ncbi.nlm.nih.gov​/​sites​/​?Db=pubmed&Cmd=Search&Term="Zhang Y"[Author]&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus​), et al. Piglets born from handmade cloning, an innovative cloning method without micromanipulation. Theriogenology (​http:​/​​/​www.fhsci.com.cn​/​javascript:AL_get(this, 'jour', 'Theriogenology.');​), 2007, 68(8):1104～1110. The Application of BLS Cell Fusion Instrument on Porcine Parthenogenetic Activation LIU Xiao1,2, ZHANG Qing-qiao3, Pan Deng-ke2* ,CHEN Kou-kou2,4, ZHANG Wei-hong2,4, FENG Chong2,4, FENG Shu-tang2 (1.Lanzhou Institute of Animal Science and Veterinary Pharmaceutics, Chinese Academy of Agricultural Sciences(CAAS) Lanzhou,730050;2.Institute of Animal Science, CAAS, BeiJing, 100094;3.Hebei University of Engineering,Handan,056038;4.Gansu Agricultural University, Lanzhou,730070) Abstract: Objective To establish and optimize the electric parameters of BLS cell fusion on porcine parthenogenetic embryo, being for the cloned ones. Methods MⅡ oocytes matured in vitro were activated by electrically stimulation with different pulses and different strength and different field duration to induce parthenogenetic Activation and further development. Conclusions Parameter (1.2KV/cm 、100μs、2 pulses) supported Higher percentages of cleavage and blastocyst (70% and 30% or so) ; BLS fusion instrument is efficient and stable for production of porcine embryos in vitro. Keywords: Porcine; Parthenogenetic activation; BLS fusion instrument