抗体亲和力从高变低的原因+提高方法

　　很多亲和力检测技术都需要提前对作用的分子进行标记处理，但标记处理常常会导致分子不是处于真正的原位环境，且可能带来其他无法预测的额外因素，为分子间相互作用的研究增加了难度。因此，无须标记、实时表征结合过程亲和力的测定方法为分子间相互作用研究提供了便捷。　　　　目前，常见的抗体亲和力测定方法根据检测原理主要包括热力学检测方法、动力学检测方法、动态平衡检测方法。比较常见的如表面等离子体共振技术（SPR）、生物膜层光干涉技术（BLI）、酶联免疫（ELISA）等。　　　　抗体(免疫球蛋白不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。　　　　抗体亲和力从高变低的原因　　　　①没有及时更换培养液，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失或者性状改变。　　　　②控制好细胞的密度，密度过大使新加入的培养基不至于很快被消耗，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失或者性状改变。　　　　③过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。　　　　④细胞被支原体等微生物污染。　　　　⑤亚克隆次数超过5次，导致细胞生长环境经常被改变，弱的阳性杂交瘤细胞染色体丢失或者性状改变。 　　　　常用的提高抗体亲和力成熟方法　　　　根据体内抗体亲和力成熟原理，在体外抗体亲和力成熟过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前的突变策略主要分为三大类，随机突变、置换和定向突变。　　　　①易错PCR　　　　易错PCR是目前最常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的基因扩增时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮PCR反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。　　　　②链置换　　　　链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。链置换策略常采用轻链替换。　　　　③定点突变　　　　由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的CDR区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，CDR区是最常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。对CDR进行定点突变时，可以对多个CDR进行平行突变或进行逐步优化。　　　　④DNA改组　　　　DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过50bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。