细胞转染的常见问题及解决方案

　　细胞转染常见问题　　　　一、转染效率低　　　　影响转染效率因素很多，主要因素有细胞培养物、血清、载体构建、DNA质量以及转染技术等。　　　　1.没有使用优化条件：优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。　　　　2.DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。　　　　3.存在抑制剂：不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素。透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。　　　　4.不恰当的细胞密度：转染时融合度应为70%-90%。　　　　5.阳离子脂质体试剂冻结：不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。　　　　6.质粒纯化的问题。　　　　二、细胞死亡率高　　　　1.DNA量太高　　　　2.阳离子脂质体试剂量太高　　　　3.在转染过程中使用抗菌素：在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。　　　　4.细胞太少　　　　5.在无血清条件下细胞活性降低：使用OPTI-MEM培养基。确保在不存在血清的条件下形成复合物。　　　　6.阳离子脂质体试剂被氧化：不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂，这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。　　　　7.对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快：在加入筛选性抗生素前至少预留24-48h使细胞表达抗性基因。   　　　　细胞转染注意事项　　　　1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。　　　　2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。　　　　3.有血清时的转染：　　　　1）在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。　　　　2）阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此在转染培养基中加入血清时需要对条件进行优化。　　　　3）大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEM培养基，一种营养丰富的无血清培养基。　　　　4.培养基中的抗生素　　　　抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素。　　　　对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素（稳定转染最常用的抗性筛选试剂）的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。　　　　5.设置阳性对照和阴性对照。　　　　6.一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。　　　　7.如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。