慢病毒转染悬浮细胞效率低的解决方法

　　病毒一直是基因转导研究中的一大利器，尤其 慢病毒 更是实验室的常客。然而，慢病毒的存储不当或用量不合适，可能会导致转染效率低，细胞状态差等情况。　　　　慢病毒感染效率低，主要需要考虑的问题有　　　　1、细胞是否适合用慢病毒进行感染？（慢病毒适用于大部分细胞系，例如肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等，但也有一些细胞不适合用慢病毒感染，可能更适合用腺病毒，可查阅文献，或咨询上海远慕生物）　　　　2、慢病毒是否进行了正确的存储和稀释？（如果病毒存储不当或反复冻融会降低病毒滴度/活性）　　　　3、感染操作问题（MOI是否合适，感染方法，感染及观察时间是否合适）　　　　4、对于一些难感染细胞的感染方法：例如悬浮细胞可使用平角离心转染法，其他一些较难感染的细胞可进行二次感染。　　　　5、可以添加助转染试剂polybrene增加感染效率　　　　慢病毒的安全和存储　　　　慢病毒相关实验需要在生物安全柜（BL-2级别）内进行操作，如果不小心溅出也不要惊慌，立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净即可。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等要用84消毒液浸泡后统一处理。病毒相关的废弃物也需要特殊收集再统一经高温灭菌处理哦。　　　　慢病毒是存储在-80℃的，如果您在收到慢病毒的一周内就会使用，也可放在4°C保存，避免反复冻融，有必要可以先进行分装。　　　　摸索病毒感染的MOI　　　　MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。　　　　用96孔板摸索梯度值：　　　　实验前一天，以每毫升3~5X10^6个目的细胞接种96孔培养板中的12个孔，　　　　体积为90 µl。感染预实验共分为四组，每组三个不同梯度的MOI。　　　　实验开始，配备1X10^8TU/ml、1X10^7TU/ml、1X10^6TU/ml病毒液。　　　　将10 µl三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为1X10^6TU，1X10^5 TU，1X10^4 TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1 X10^4个，所以三个孔的MOI分别为100、10、1　　　　感染3-4天后，观察荧光表达情况，通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。　　　　每孔加病毒量（µl）=MOI*细胞数/滴度（ＴＵ／ｍｌ）×１０００　　　　确定了细胞的MOI值，下面就要开始进行细胞的感染　　　　推荐１／２小体积感染法，即在正常培养液的一半量的情况下加入慢病毒，感染４ｈ后补足培养液至正常体积，感染２４ｈ后换液。对于适用Polybrene的细胞，也可适量加入来提升感染效率，它最常用的工作浓度为6~8µg/ml。　　　　感染后４８ｈ，对于带ＧＦＰ报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，如果要筛选稳定携带Puromycin抗性基因的病毒，则需换上含适当浓度Puromycin的新鲜完全培养液。　　　　注：不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI值也略有差异，以下数据是在细胞感染效率在85-100%细胞状态良好的情况下获得的，仅供参考。　　　　对于一些特殊的细胞在感染时还要注意以下事项　　　　◆悬浮细胞：感染悬浮或半悬浮细胞，要通过平角离心转染法，低速（200´g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替。　　　　◆极难感染的细胞：对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。　　　　◆传代能力较差的原代细胞：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。