流式细胞术实验步骤

流式细胞术（flowcytometry，FCM）是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，使被测溶液流经测量区域，并逐一检测其中每一个细胞的物理和化学特性，从而对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。首先，待测细胞经处理或染色后被压人流动室，与此同时，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能被包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在包绕下单行排列，依次通过检测区域。在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两个光源信号分别反映了细胞体积的大小和内部的信息。经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模，数转换器。将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，经计算机处理，可将分析结果显示在屏幕上。为了保证细胞单个排列地逐一通过检测区域，鞘流技术在流式细胞术中被广泛应用。根据层流理论，由于两种液体的流速和压力不同。在一定条件下样品溶液与包裹它的鞘液在流动中可以保持相互分离并且同轴。同时鞘液流可以加速样品溶液中颗粒的流动并迫使他们的流动轨迹保持在液流的中轴线上，使细胞单排列地逐一通过检测区域，这便是所谓的液流聚焦原理。流式细胞术实验：1、制备细胞悬液，计数2、分装，按照每个EP（1.5ml）管1-2*10 6个细胞分装，3500rpm，4度离心。3、用100ulPBS重悬，加入10ul大鼠血清封闭，4度避光30min。4、加入相应的荧光标记的抗体，混匀，避光，4度孵育30min。5、加入1mlPBS洗两遍。6、用200ul PBS重悬，经纱布过滤转至流式管，上级检测。细胞或者大小接近的颗粒物质都可以检测。样本通过鞘液的输送，成单个队列依次通过激光束。样本事先可以根据检测需要被荧光标记，通过激光束的时候就会得到荧光信号，被记录下来。可以同时标记不同的荧光标记做不同的检查。优点就是可以在短时间内检测大量的样本（每秒几千个到几万个细胞）。主要应用于各种生物医学研究和临床诊断。国际上通用的白细胞和淋巴瘤的诊断标准就是靠流式细胞仪的分型来确定的。